【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，涉及一种提高磷酸调节子传感器激酶phor的表达水平的方法。
技术介绍
1、磷酸调节子传感器激酶phor是一种锚定内膜蛋白，由n端跨膜结构域、带电连接子结构域、pas结构域、二聚化和组氨酸磷酸受体结构域和c端激酶结构域这五个结构域组成。phor是phorb双组分信号转导途径的传感器激酶，通过磷酸化或去磷酸化其同源反应调节剂phob来间接感知和响应细胞外无机磷酸盐水平的变化，其信号传感和激酶结构域位于细胞质中。此外，phor可以在体外磷酸化非同源重子酶调节剂kdpe，并且在没有kdpd的情况下，它可以诱导体内kdpfabc的表达；由此产生的phorb和kdpde双组分系统之间的双向串扰可用于微调细胞中k+和磷酸盐的平衡。因此，对于phor蛋白的研究具有重要的意义。
2、然而，phor蛋白具有n端跨膜结构域，是一种内膜蛋白，结构复杂，因而折叠容易出现错误，且膜蛋白的大规模制备一直是生物学研究的难点和热点。因此需要克服phor蛋白折叠易发生错误及表达量低的两大难题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种提高磷酸调节子传感器激酶phor的表达水平的方法，以实现磷酸调节子传感器激酶phor的大量表达。本专利技术针对大肠杆菌磷酸调节子传感器激酶phor建立了高效的融合表达系统，从而提高了磷酸调节子传感器激酶phor的表达量，并且可以用于后续的蛋白纯化。
2、实现本专利技术目的的技术方案如下：
3、提高磷酸调节子传感器激酶pho
4、步骤1，磷酸调节子传感器激酶phor的表达载体的构建：pcr扩增膜蛋白phor目的基因，使用ncoi和bamhi对目的片段和重组的pet28a质粒进行双酶切，回收酶切产物，再用t4连接酶将回收的目的基因片段和重组的pet28a质粒片段连接，得到表达质粒为pcy002-phor，所述的pcy002-phor包含：噬菌体t7启动子，大肠杆菌核糖体结合位点，ncoi序列ccatgg，如seq id no.1所示的大肠杆菌膜蛋白phor序列，bamhi位点ggatcc，tev蛋白酶切割位点gagaacctgtacttccaatcc，ndei酶切位点catatg，如seq id no.2所示的超级折叠绿色荧光蛋白编码序列，xhoi酶切位点ctcgag，6个组氨酸位点以及t7终止子，pcy002-phor的核苷酸序列如seq id no.3所示。
5、步骤2，pcy002-phor质粒的验证及克隆：将重组质粒pcy002-phor转化至宿主大肠杆菌中，并涂布于含卡那霉素的琼脂平板中，挑选单克隆菌落进行菌落pcr验证及单、双酶切验证，使用碱裂解法提取验证正确的质粒并进行测序验证；
6、步骤3，目的蛋白的诱导表达：将验证正确的质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)表达菌株中，使用iptg大规模诱导表达融合蛋白，诱导时间为2-4h，诱导温度为30℃。
7、优选地，步骤1中，回收的目的基因片段和重组的pet28a质粒片段按4:1的摩尔比进行连接。
8、优选地，步骤1中，回收的目的基因片段和重组的pet28a质粒片段的连接条件为：22℃下连接2h。
9、优选地，步骤2中，宿主大肠杆菌为大肠杆菌dh5α感受态细胞。
10、优选地，步骤3中，iptg的终浓度为1mm。
11、本专利技术通过在核酸编码一级序列进行优化，合成编码磷酸调节子传感器激酶phor的基因，将目的基因通过ncoi和bamhi双酶切连接至包含超级折叠绿色荧光蛋白标签的重组质粒pet28a中形成融合表达载体pcy002-phor。超级折叠绿色荧光蛋白不仅可以用于实时监测蛋白质的表达进程，还可以帮助目标膜蛋白进行正确折叠，从而稳定膜蛋白的构象。此外，超级折叠绿色荧光蛋白可以促进膜蛋白的溶解，能够进一步地提高膜蛋白的表达量。本专利技术通过对大肠杆菌膜蛋白phor表达菌株、诱导温度及诱导时间等条件的优化，获得了磷酸调节子传感器激酶phor的最佳表达条件，大大提高了磷酸调节子传感器激酶phor的表达量。
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1.提高磷酸调节子传感器激酶PhoR的表达水平的方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，回收的目的基因片段和重组的pET28a质粒片段按4:1的摩尔比进行连接。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，回收的目的基因片段和重组的pET28a质粒片段的连接条件为：22℃下连接2h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中，宿主大肠杆菌为大肠杆菌DH5α感受态细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中，IPTG的终浓度为1mM。
【技术特征摘要】
1.提高磷酸调节子传感器激酶phor的表达水平的方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，回收的目的基因片段和重组的pet28a质粒片段按4:1的摩尔比进行连接。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中...
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