一种海绵共附生真菌及其在制备海松烷二萜类化合物中的应用制造技术

技术编号：41403445 阅读：6 留言：0更新日期：2024-05-20 19:29

本发明专利技术公开了一种海绵共附生真菌及其在制备海松烷二萜类化合物中的应用，特点是该菌株为NBUF145菌株，于2023年11月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63905，从海绵共附生真菌中分离得到的化合物结构式如下化合物1所示，其制备方法步骤包括将上述真菌通过微生物发酵培养获取发酵物，然后将发酵物用乙酸乙酯提取，得粗浸膏，然后将该粗浸膏经减压硅胶柱层析，凝胶柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到海松烷二萜类化合物，优点是该海松烷二萜类化合物能发挥抗破骨药物的作用。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及海绵共附生真菌，尤其是涉及一种海绵共附生真菌及其在制备海松烷二萜类化合物中的应用。

技术介绍

1、海绵共附生微生物蕴含着许多结构新颖的次级代谢产物，主要包括大环内酯类、聚酮类、环肽类、生物碱类等，这些化合物往往具有强的抗菌、抗肿瘤等药理活性，近年来已成为海洋天然产物研究的热点之一。海绵来源的微生物主是真菌和细菌，尤以真菌中次级代谢产物种类繁多、活性独特而备受重视。据报道，海洋中光层(30m～150m水下)在海洋中拥有超过80％的生物多样性，对海洋生物进行的研究被认为是开创性的，从中鉴定出了大量的海洋天然产物。这些都是药物发现的非常有价值的资源。

2、在已研究过的众多海洋生物中，海绵相关真菌产生了大量具有有趣结构和显著生物活性的分子，例如具有神经氨酸酶抑制活性的对三联苯、抗炎倍半萜、具有wnt/β-catenin通路抑制作用的氧杂蒽酮异二聚体等。本专利技术人研究获知从海洋中光层海绵共附生真菌(pestalotiopsis sp.nbuf145)次级代谢产物中分离获得的一种二萜类化合物，通过18s rrna测序发现该株真菌疑似新种，进一步对其次级代谢产物进行分离纯化及活性评价。目前尚未见该化合物的化学结构及活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。

技术实现思路

1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种海绵共附生真菌及其在制备海松烷二萜类化合物中的应用，该海松烷二萜类化合物1对破骨细胞分化具有显著的抑制作用。

2、本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：

3、1、一种海绵共附生真菌，该菌株为nbuf145菌株，于2023年11月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:63905。

4、2、一种海绵共附生真菌在制备海松烷二萜类化合物中的应用，该化合物从海绵共附生真菌(pestalotiopsis sp.)次级代谢产物中分离得到，其结构式如下所示：

5、

6、3、上述海绵共附生真菌在制备海松烷二萜类化合物中的应用，该海松烷二萜类化合物的制备方法具体步骤如下：

7、(1)发酵培养

8、将保藏号为gdmcc no:63905的海绵共附生真菌(pestalotiopsis sp.)在马铃薯葡萄糖固体培养基上活化3～4天后，接种到察氏培养基中，然后置于摇床上培养，于28℃和120rpm条件下培养16天，得到发酵产物；

9、(2)浸膏提取

10、将步骤(1)得到的发酵产物用与发酵产物等体积的乙酸乙酯重复萃取3次，合并三次萃取所得萃取液，旋转蒸发至干后，获得粗浸膏；

11、(3)化合物的分离制备

12、将步骤(2)得到的粗浸膏采用硅胶柱色谱法(cc)进行柱层析，采用乙酸乙酯为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液进行lh-20凝胶柱层析，采用体积比为4:1的甲醇-二氯甲烷溶液为洗脱剂进行洗脱，按序合并相似流分，按流分极性从小到大排列，得到10个组分，将收集的第4个组分，采用半制备反相高效液相色谱对化合物进行分离纯化，洗脱剂为乙腈与水按体积比23:77的比例混合而成，分离得到海松烷二萜类化合物，结构式如下所示：

13、

14、进一步，步骤(1)中所述的察氏培养基配制方法如下：将蔗糖30.0g、硝酸钠3.0g、七水硫酸镁0.5g、七水硫酸亚铁0.001g、磷酸二氢钾1.0g、氯化钾0.5g、酵母提取物1.0g、海盐35.0g和适量的水混合，使其总体积为1l。

15、进一步，步骤(3)中所述的半制备反相高效液相色谱的流速为2.00ml/min。

16、上述海松烷二萜类化合物在制备破骨细胞分化抑制剂方面的用途。

17、与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术一种海绵共附生真菌及其在制备海松烷二萜类化合物中的应用，通过一株海绵共附生真菌(pestalotiopsis sp.)发酵培养来获取杂萜类化合物的发酵物，然后将发酵物用乙酸乙酯提取，得粗浸膏，将该粗浸膏经凝胶柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到化合物，体外生物测定显示，该化合物可抑制破骨细胞的生成，其ic50值为4.2±0.2μm；同时，化合物对骨髓单核细胞(bmms)的细胞毒性较低，cc50值均超过30μm，表明其具有一定的选择性。此外，化合物在5.0μm和10.0μm浓度下抑制erk1/2-jnk1/2-p38丝裂原活化蛋白激酶(mapks)的磷酸化，其作用呈剂量依赖性。此外，化合物1对nf-κb核转位也有抑制作用，这在10.0μm时尤为明显。由于mapk信号的磷酸化和nf-κb核转位对破骨细胞的分化至关重要，因此化合物1可通过这种作用机制作为抗破骨细胞生成剂。

18、上述一株中光层海绵共附生真菌(pestalotiopsis sp.)，该菌为nbuf145菌株，保藏编号为gdmcc no:63905，于2023年11月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。

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【技术保护点】

1.一种海绵共附生真菌，其特征在于：该菌株为NBUF145菌株，于2023年11月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63905。

2.一种海绵共附生真菌在制备海松烷二萜类化合物中的应用，其特征在于：该化合物从海绵共附生真菌Pestalotiopsis sp.次级代谢产物中分离得到，结构式如下所示：

3.一种根据权利要求2所述的海绵共附生真菌在制备海松烷二萜类化合物中的应用，其特征在于该海松烷二萜类化合物的制备方法具体步骤如下：

4.根据权利要求3所述的一种海绵共附生真菌在制备海松烷二萜类化合物中的应用，其特征在于步骤(1)中所述的察氏培养基配制方法如下：将蔗糖30.0g、硝酸钠3.0g、七水硫酸镁0.5g、七水硫酸亚铁0.001g、磷酸二氢钾1.0g、氯化钾0.5g、酵母提取物1.0g和海盐35.0g加入水中混合，使其总体积为1L。

5.根据权利要求3所述的一种海绵共附生真菌在制备海松烷二萜类化合物中的应用，其特征在于：步骤(3)中所述的半制备反相高效液相色谱的流速为2.00mL/min。