一种高产法尼醇基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种高产法尼醇基因工程菌的构建方法，是利用同源重组的方式在酿酒酵母中整合表达MVA途径限速酶

【技术实现步骤摘要】
一种高产法尼醇基因工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及微生物发酵
，尤其涉及一种高产法尼醇基因工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]法尼醇(Farnesol)分子式：C
15
H
26
O，又名法呢醇，合金欢醇，里哪醇，菌绿烯醇，麝子油醇，是一种具有芳香气味的非环状倍半帖醇。广泛分布于许多植物精油中，也存在于动物和微生物中,在信号转导、群体感应和细胞凋亡诱导等过程中发挥重要作用,可以作为杀菌清洁剂、杀虫剂、昆虫引诱剂。它是重要化工生产原料，被广泛应用于化妆品和医学药物的工业化生产，也可作为航空燃料的理想替代品。
[0003]法尼醇可以从植物中分离提取，但提取步骤繁琐，且质量与原料息息相关，而经化学方法合成的法尼醇，往往存在异构体混杂、毒性大等问题。除此之外，微生物发酵也是法尼醇的一个来源，微生物发酵法具有条件温和，不受地理和气候影响和容易进行大规模生产等优势，但目前能用于发酵生产法尼醇的菌株的产量都普遍偏低，且菌株稳定性很差，很难用于工业化生产。因此，构建高产稳定的法尼醇本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产法尼醇基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、构建酿酒酵母MVA途径相关基因表达模块：过表达tHMG1模块，包括诱导型双向强启动子pGAL1
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10和MVA途径限速酶编码基因tHMG1，所述pGAL1
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10的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，所述tHMG1的核苷酸序列如SEQ NO.2所示；S2、构建法尼醇生产相关基因表达模块：ERG20
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Linker
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PAH1模块，包括FPP合酶的编码基因ERG20和酿酒酵母内源性磷酸酶的编码基因PAH1，所述ERG20的核苷酸序列如SEQ NO.3所示，所述PAH1的核苷酸序列如SEQ NO.4所示；S3、构建敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的工程菌：将步骤S1所述酿酒酵母MVA途径相关基因表达模块和步骤S2所述法尼醇生产相关基因表达模块整合至半乳糖调节蛋白GAL80基因位点，同时敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因，得到敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块，将所述敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块转化至构建的酿酒酵母基因工程菌GS
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A3中，经多次基因工程操作，获得敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的基因工程菌；S4、构建角鲨烯合酶途径下调表达质粒，包括将铜离子诱导启动子pCUP1替换为角鲨烯合酶基因ERG9启动子，所述pCUP1的核苷酸序列如SEQ NO.5所示；所述角鲨烯合酶基因ERG9启动子取至ERG9基因起始密码子前450bp，其核苷酸序列如SEQ NO.6所示；S5、将步骤S5所述角鲨烯合酶途径下调表达质粒转化至步骤S3所述的敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的基因工程菌中，依次经抗生素抗性筛选，然后通过菌落PCR验证，获得高产法尼醇基因工程菌；所述构建方法还包括两个终止子tCYC1和tERG20，所述终止子tCYC1的核苷酸序列如SEQ NO.7所示，所述终止子tERG20的核苷酸序列如SEQ NO.8所示。2.如权利要求1所述的一种高产法尼醇基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤S1中，所述过表达tHMG1模块的构建方法包括以下步骤：S1、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用tCYC1
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F和tCYC1
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R、tHMG1
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F和tHMG1
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R、pGAL1pGAL10
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F和pGAL1pGAL10
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R引物进行PCR反应，获得DNA片段tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1；S2、将步骤S1获得的三个DNA片段tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1，通过用引物tCYC1
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F和pGAL1pGAL10
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R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得过表达tHMG1模块，即tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1模块。3.如权利要求1所述的一种高产法尼醇基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤S2中，所述ERG20
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Linker
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PAH1模块的构建方法包括以下步骤：S1、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用ERG20
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F和ERG20
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Linker
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R引物进行PCR反应，扩增得到DNA片段ERG20_Linker；S2、用引物Linker
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PAH1
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F和PAH1
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R进行PCR反应，扩增得到DNA片段Linker_PAH1；S3、用引物tERG20
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F和tERG20
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R进行PCR反应，扩增得到DNA片段tERG20；S4、将步骤S1获得的DNA片段ERG20_Linker、步骤S2获得的DNA片段Linker_PAH1和步骤S3获得的DNA片段tERG20，通过用引物ERG20
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F和tERG20
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R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得融合表达ERG20
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Linker
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PAH1模块，即ERG20_Linker_PAH1_tERG20。4.如权利要求3所述的一种高产法尼醇基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述
Linker包括甘氨酸和丝氨酸，其组合结构包括GSG、GGGS和GSGGSG中的任一种，其中G对应核酸序列GGT，S对应核酸序列TCT。5.如权利要求4所述的一种高产法尼醇基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤S2中，所述ERG20
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Linker
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PAH1模块中的Li...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈强，刘登辉，向景，刘传春，
申请(专利权)人：湖北冠众通科技有限公司，
类型：发明
国别省市：