参与烟草盐胁迫反应的基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种参与烟草盐胁迫反应的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术将得到的基因构建到基因编辑的表达载体，将获得的基因编辑的烟草植株进行盐胁迫反应后其过氧化物酶、脯氨酸含量提高，特别是脯氨酸含量提高明显。脯氨酸含量提高明显。脯氨酸含量提高明显。

【技术实现步骤摘要】
参与烟草盐胁迫反应的基因及其应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及参与烟草盐胁迫反应的基因及其应用。

技术介绍

[0002]CIPK(CBL
‑
interacting protein kinase)是一类具有生物活性的丝/苏氨酸蛋白激酶，通过与类钙调神经素B亚基蛋白(Calcineurin B
‑
like protein，CBL)相互作用从而调节植物在适应或抵制非生物逆境胁迫中的生理活动。目前已经从许多植物中克隆到这个家族基因(Tang等2014；Weinl等2009)。CIPK在植物响应高盐、低温、高温和低钾信号转导过程中发挥重要作用。野大麦HbCIPK2在干旱、高盐和ABA胁迫下表达增强(Li等2012)。拟南芥和马铃薯中CIPK23参与低钾胁迫的反应(Xu等2006；王婉晶，2017)，烟草NtCIPK23受到干旱、盐胁迫诱导(闫亚飞2012)。目前在一些植物(水稻、拟南芥、马铃薯等)中CIPK23基因已经被报道相关功能，但烟草CIPK23基因在盐胁迫中的功能未知。
[0003]为解决上述问题提出本专利技术。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是获得烟草CIPK23基因编辑材料并进行功能分析。本专利技术从烟草中克隆得到CIPK基因，见所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列全长1314bp碱基。具体技术方案是，参考GenBank收录烟草CIPK序列，登陆号是XM_016583370.1，采用Primer5.0软件设计引物，见表1。扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸90s；35个循环。目的片段纯化后与pMD19
‑
T载体16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，随后在涂有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，采用菌落PCR检测阳性克隆。检测后随机选取三个独立的阳性克隆送生物技术公司进行测序。本专利技术烟草CIPK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该烟草CIPK23基因核苷酸序列全长1314bp。随后将该基因构建到基因编辑的表达载体，利用农杆菌介导的方法进行烟草红花大金元遗传转化，利用获得的基因编辑材料进行功能研究特别是盐胁迫研究。
[0005]本专利技术第一方面公开了一种参与烟草盐胁迫反应的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括1314bp个碱基。
[0006]优选地，所述参与烟草盐胁迫反应的基因的编码蛋白。
[0007]优选地，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括437个氨基酸。
[0008]本专利技术第二方面公开了所述的参与烟草盐胁迫反应的基因的应用，将所述基因构建到基因编辑的表达载体，利用农杆菌介导的方法进行烟草遗传转化，然后将获得的基因编辑的烟草植株进行烟草盐胁迫反应。
[0009]优选地，所有烟草植株、包括对照烟草植株(即普通烟草植株)与基因编辑后的烟草植株盐胁迫后其过氧化物酶含量、脯氨酸含量提高，特别是脯氨酸含量提高明显；但叶绿素含量低于正常生长的烟草植株和基因编辑后的烟草植株。
[0010]优选地，所述基因编辑后的烟草植株盐胁迫后，其过氧化物酶含量和脯氨酸含量均高于对照烟草植株，特别是脯氨酸含量明显较高；但过氧化氢浓度略低于对照烟草植株。
[0011]本专利技术的有益效果：
[0012]1、本专利技术通过克隆得到烟草CIPK23基因，其核苷酸序列如如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列全长1314bp个碱基。
[0013]2、本专利技术将得到的CIPK23基因构建到基因编辑的表达载体，利用农杆菌介导的方法进行烟草遗传转化，然后将获得的基因编辑的烟草植株进行烟草盐胁迫反应后，其过氧化物酶、脯氨酸含量提高，特别是脯氨酸含量提高明显。
附图说明
[0014]图1为本专利技术的CIPK23基因的电泳图。
[0015]图2为CIPK23基因编辑的烟草植株盐处理表型检测；HD为对照样即普通烟草植株，T1
‑
T3为基因编辑后的烟草植株；其中左边为正常生长，右边为盐处理后。
[0016]图3为CIPK23基因编辑的烟草植株盐处理后叶绿素含量测定；HD为对照样即普通烟草植株，T1
‑
T3为基因编辑后的烟草植株；其中左边为正常生长，右边为盐处理。
[0017]图4为CIPK23基因编辑的烟草植株盐处理后过氧化物酶(POD)含量测定；HD为对照样即普通烟草植株，T1
‑
T3为基因编辑后的烟草植株；其中左边为正常生长，右边为盐处理。
[0018]图5为CIPK23基因编辑的烟草植株盐处理后过脯氨酸含量测定；HD为对照样即普通烟草植株，T1
‑
T3为基因编辑后的烟草植株；其中左边为正常生长，右边为盐处理。
[0019]图6为CIPK23基因编辑的烟草植株盐处理后过氧化氢浓度测定；HD为对照样即普通烟草植株，T1
‑
T3为基因编辑后的烟草植株；其中左边为正常生长，右边为盐处理。
具体实施方式
[0020]以下通过实施例来详细说明本专利技术的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本专利技术的技术方案，而不能解释为是对本专利技术技术方案的限制。在本申请的各实施例中，没有注明具体技术或条件者，按照本领域内现有技术或条件进行，所使用的材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本专利技术除非另有说明，否则百分号为体积百分数，比例为体积比。
[0021]实施例1：基因克隆及烟草植株基因编辑
[0022]1、基因克隆
[0023]取0.5g烟草新鲜叶片，采用Trizol法提取烟草细胞的总RNA，然后采用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒合成cDNA，进一步采用Primer5.0软件设计引物对cDNA进行PCR扩增，引物见下表1。
[0024]扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸90s；35个循环。目的片段纯化后与pMD19
‑
T载体16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，随后在涂有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，采用菌落PCR检测阳性克隆。检测后随机选取三个独立的阳性克隆送生物技术公司进行测序，得到的烟草CIPK23基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该烟草CIPK23基因核苷酸序列全长1314bp碱基。
[0025]表1引物列表
[0026][0027]图1为得到的CIPK23基因的电泳图。
[0028]2、目的基因连接表达载体
[0029]将上述转化好的T
‑
载体与基因编辑的表达载体进行双酶切，回收目的基因和表达载体，然后用连接酶连接，将连接后的重组表达载体转入大肠杆菌DH5α的感受态细胞，对转化后的大肠杆菌单菌落进行PCR扩增，然后挑取阳性菌落扩繁、提取质粒进行酶切本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种参与烟草盐胁迫反应的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的参与烟草盐胁迫反应的基因，其特征在于，所述基因的编码蛋白。3.根据权利要求2所述的参与烟草盐胁迫反应的基因，其特征在于，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的参与烟草盐胁迫反应的基因的应用，...

【专利技术属性】
技术研发人员：许力，许永，王凯，高茜，杨文武，米其利，李雪梅，向海英，曾婉俐，蒋佳芮，鲁逸飞，邓乐乐，张建铎，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：