一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法技术

一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术公开了一株过表达Are2和Yft2基因的同时替换SEI1及Tgl1基因的酿酒酵母基因工程菌，所述酿酒酵母由原始酿酒酵母利用同源重组技术替换基因后改造而成。由于原始菌株BY4741自身存储甾醇类物质的量有限，并且过量积累的脂质中间体会产生产物抑制作用，不仅直接影响目标产物的合成，而且会引发细胞毒性，降低细胞活力。改造后的耐油酿酒酵母基因工程菌较原始出发菌株显著提升了细胞油脂存储单元脂滴结构的体积占比，有效地降低了脂质累积引起的细胞毒性和产物抑制，显著提升了酯类化合物的胞内累积量，为突破酯类类化合物酿酒酵母从头合成极限提供了新的策略以及良好的耐受细胞模型。新的策略以及良好的耐受细胞模型。新的策略以及良好的耐受细胞模型。

【技术实现步骤摘要】
一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法。

技术介绍

[0002]脂类化合物是一种多样且普遍存在的化合物，如脂肪酸、磷脂、甾醇、鞘脂、萜烯等，具有许多关键的生物学功能，参与细胞膜的结构组成、能量的储存和信号转导等过程，是医药、食品及大宗化学品的代表性产品。
[0003]酿酒酵母具有较为完备的遗传操作优势、分子信息的高获得性、传代时间短、易于培养和对有机溶剂的高耐受性，经常被用作通过代谢工程生产高价值药物的重要底盘。通过强化脂肪酸合成途径，实现在酿酒酵母细胞底盘的脂肪醇、脂肪酸及其衍生物的高效合成，从而搭建油脂平台化合物的从头合成的新途径。此外，酿酒酵母具有内源性的甲羟戊酸途径，能够稳定提供前体异戊烯焦磷酸、二磷酸二甲基烯丙酯和2,3
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环氧角鲨烯，其完整内膜系统和翻译后修饰有利于环化酶和P450酶的活性表达，借助其完善的遗传操作平台，已成为萜类化合物、黄酮类化合物等多种输水性酯类化合物从头合成的重要底盘，以构建了包括紫杉二烯、青蒿酸，法呢烯、α
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檀香烯、人参皂甙、香叶醇等多种天然产物的从头合成路径。由此可见，酿酒酵母作为酯类化合物从头的合成底盘，具有重要的开发及应用潜力。
[0004]在酿酒酵母发酵生产酯类化合物的反应体系中，廉价的油酸作为油脂合成前体，是替代葡萄糖等简单碳源促进酯类化合物细胞合成的重要碳源替代物。此外，在输水性油脂化合物发酵合成路线中，油
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>水两相反应体系的应用不但能够及时富集产物在油相的累积，减轻水相细胞中的产物抑制效应，也同时能够简化后续产品的分离提取，是一种理想的微生物发酵体系。但大部分野生型酿酒酵母在油酸培养基生长条件下呈现生物量明显降低，细胞耐受差等表型，不利于油酸碳源的有效利用及脂质化合物的高效转化。因此，利用基因工程改造技术获得油脂耐受性较高的酿酒酵母菌对提升脂质化合物的从头合成及廉价碳源利用具有重要意义。
[0005]脂质的合成、运输、储存和其他过程都受到酿酒酵母内膜系统的动态和精确调节，是最终影响产量的关键因素。由于细胞内空间有限，单纯提高关键限速酶的活性无法彻底突破细胞脂质合成和储存的限制。近年来，细胞器的理性改造技术已成为除了强化目标产物代谢通量之外的另一种合理强化策略。其中，脂滴作为酵母细胞脂质储存最重要的细胞器，以中性脂质为核心，由单层磷脂包裹，允许细胞将非极性分子储存在特定的隔间中，实现非极性分子与细胞的水环境的隔离。脂滴结构的修饰和储存的加强有效地降低了脂质积累引起的细胞毒性和产物抑制，使细胞突破了脂质合成的极限。因此，如何通过定向的基因工程改造提升细胞脂滴存储单元，减轻细胞内脂质积累和提高单细胞的脂质存储量效率对强化输水性酯类化合物在酿酒酵母细胞的高效合成尤为重要。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法的技术方案。
[0007]本专利技术第一方面提供了一种耐油酿酒酵母基因工程菌。
[0008]为了实现上述技术问题，本专利技术选取Are2(NC_001146.8)、Yft2(NC_001136.10)、SEI1(NC_001144.5)及Tgl1(NC_001143.9)基因作为改造对象，构建酿酒酵母基因工程菌，以增加脂滴大小及含量，降低脂质积累引起的细胞毒性和产物抑制，使细胞突破脂质合成极限，具体是通过原始酿酒酵母过表达Are2和Yft2基因，同时靶向敲除SEI1及Tgl1基因后获得了耐油酿酒酵母基因工程菌株，所述Are2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Yft2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述原始酿酒酵母为BY4741，购自欧洲酿酒酵母功能分析中心(http://www.euroscarf.de/search.php？name＝Order)。
[0009]进一步地，上述四个目标基因是结合油酸诱导的应激模型及适应性驯化菌株的转录组差异基因及其功能注释筛选获得。在酵母细胞中，甾醇通常以游离甾醇或甾酯形式存在，其中甾酯为甾醇的储存形式，甾醇的酯化与水解可以缓冲游离甾醇的过量与缺乏，使其达到稳态。其中，乙酰辅酶A甾醇酰基转移酶Are2可使游离甾醇酯化转变为储存形式；乙酰辅酶A二磷酸酶Yft2能维持内质网膜稳定并影响细胞能量稳态；而酿酒酵母中的Tgl1和SEI1蛋白对甾醇的储存可能具有逆向影响，因此选择上述基因进行定向改造。
[0010]本专利技术第二方面提供了一种耐油酿酒酵母基因工程菌的构建方法。
[0011]为了实现上述技术问题，本专利技术通过以下步骤实现：
[0012](1)提取原始酿酒酵母的基因组DNA；
[0013](2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，在SEI1基因的上下游各设置同源臂且同源臂不包含此靶向序列；以上游同源臂、G418抗性基因序列、Are2基因序列和下游同源臂为模板，通过融合PCR扩增得到SEI1::Are2基因替换组件；
[0014](3)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，在Tgl1基因的上下游各设置同源臂且同源臂不包含此靶向序列；以上游同源臂、hph抗性基因序列、Yft2基因序列和下游同源臂为模板，通过融合PCR扩增得到Tgl1::Yft2基因替换组件；
[0015](4)将步骤(2)和(3)得到的SEI1::Are2及Tgl1::Yft2基因替换片段转化至原始酿酒酵母感受态中，即得SEI1::Are2及Tgl1::Yft2基因替换的酿酒酵母基因工程菌。
[0016]进一步，步骤(2)中Are2基因启动子替换成GAP强启动子，所述GAP强启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0017]进一步，步骤(2)中SEI1::Are2基因替换组件的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0018]进一步，步骤(3)中Yft2基因启动子替换成GAP强启动子，所述GAP强启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0019]进一步，步骤(3)中Tgl1::Yft2基因替换组件的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0020]进一步，步骤(4)中利用含有500ug/mLG418和500ug/mLhph的YPD培养基筛选获得阳性转化子，得到SEI1::Are2和Tgl1::Yft2双基因替换的酿酒酵母基因工程菌。
[0021]本专利技术第三方面提供了一种耐油酿酒酵母基因工程菌在提升酿酒酵母耐油性中的应用。
[0022]本专利技术第四方面提供了耐油酿酒酵母基因工程菌表型鉴定及高通量筛选的方法。
[0023]为了实现上述技术问题，本专利技术通过以下方法实现：
[0024]其中，耐油酿酒酵母基因工程菌株于YPD培养基中进行48h培养，期间每隔6h在超净台中吸取适量培养细胞悬浮液并稀释至适当浓度，通过分光光度计测量OD
600
值；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐油酿酒酵母基因工程菌，其特征在于该基因工程菌通过原始酿酒酵母过表达Are2和Yft2基因，同时靶向敲除SEI1及Tgl1基因后获得。2.如权利要求1所述的一种耐油酿酒酵母基因工程菌，其特征在于所述Are2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Yft2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.如权利要求1所述的一种耐油酿酒酵母基因工程菌，其特征在于所述原始酿酒酵母为BY4741。4.如权利要求1
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3任一所述的一种耐油酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)提取原始酿酒酵母的基因组DNA；(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，在SEI1基因的上下游各设置同源臂且同源臂不包含此靶向序列；以上游同源臂、G418抗性基因序列、Are2基因序列和下游同源臂为模板，通过融合PCR扩增得到SEI1::Are2基因替换组件；(3)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，在Tgl1基因的上下游各设置同源臂且同源臂不包含此靶向序列；以上游同源臂、hph抗性基因序列、Yft2基因序列和下游同源臂为模板，通过融合PCR扩增得到Tgl1::Yft2基因替换组件；(4)将步骤(2)和(3)得到的SEI1::Are2及Tgl1::Yft2基因替换片段转化至原始酿酒酵母感受态中，即得...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，曹丽莎，沈逸，柯霞，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：