一种以葡萄糖为底物微生物合成白藜芦醇的工程菌、构建及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种以葡萄糖为底物微生物合成白藜芦醇的工程菌、构建和应用，属于生物技术领域。本发明专利技术整合了L

【技术实现步骤摘要】
一种以葡萄糖为底物微生物合成白藜芦醇的工程菌、构建及应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种以葡萄糖为底物生物合成白藜芦醇的工程菌、构建及应用。

技术介绍

[0002]白藜芦醇,又称为芪三酚,是一种从植物中提取的天然的非黄酮类多酚化合物，属于二苯乙烯类化合物。白藜芦醇在植物中主要有4种存在形式:反式白藜芦醇、顺式白藜芦醇、反式白藜芦醇苷和顺式白藜芦醇苷,其中以反式形式为主,且反式白藜芦醇的生物活性高于顺式白藜芦醇，存在于虎杖、葡萄、花生等多种植物中，并且葡萄中白藜芦醇的含量是所有水果中含量最高的，主要涉及植物的根、茎、叶、花、果实和种子等部位,是植物处于逆境下产生的一种植物抗毒素。白藜芦醇具有诸多有益健康的生理作用，白藜芦醇可清除自由基，抑制由活性氧引起的脂质过氧化和脂蛋白修饰，从而起到对心血管系统的保护作用。白藜芦醇通过调节转录因子、控制小RNA表达等机理表现出抗癌活性。
[0003]白藜芦醇是一种植物次级代谢产物，白藜芦醇已被证明在抗氧化、抗炎、抗癌、雌激素、神经保护、心脏保护、抗动脉粥样硬化、抗衰老、抗糖尿病、抗骨质疏松和减肥中的调节作用，备受人们的青睐，在医药、保健品、化妆品等方面有着广阔的应用前景。研究表明，白藜芦醇可通过多种机制、多个靶点发挥抗肿瘤作用,尤其是近年来在临床上对细胞癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、白血病等多种肿瘤细胞均有显著抑制作用，所以成为人们研究的热点。解脂耶氏酵母是一种重要的工业微生物菌种，被公认为食品级安全微生物，其优点很多，包括全基因组序列已测定、遗传操作性强、底物利用范围广泛以及能大量分泌多种代谢产物等，目前它已被运用于多个领域。在这里，我们整合了L
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酪氨酸氨解酶、对香豆酰基辅酶A连接酶和白藜芦醇合成酶的基因工程菌株，利用hp4d启动子使L
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酪氨酸氨解酶、对香豆酰基辅酶A连接酶、白藜芦醇合成酶、DAHP合成酶和分支酸变位酶在解脂耶氏酵母中表达，从而提高了白藜芦醇产物产量，为大规模工业化生产白藜芦醇提供了支撑。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的之一是提供一种以葡萄糖为底物生物合成白藜芦醇的工程菌、构建及应用。该工程菌通过表达L
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酪氨酸氨解酶、对香豆酰基辅酶A连接酶、白藜芦醇合成酶、DAHP合成酶和分支酸变位酶，实现以葡萄糖为底物生物合成白藜芦醇。
[0005]本专利技术的目的之二是提供一种以葡萄糖为底物微生物合成白藜芦醇的工程菌株的构建方法。本专利技术系统利用酶偶联法同时催化三个反应体系，三个酶体系分别为L
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酪氨酸在L
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酪氨酸氨解酶催化下生成对香豆酸、对香豆酰基辅酶A连接酶催化对香豆酸生成对香豆酰基辅酶A，然后白藜芦醇合成酶酶体系下生白藜芦醇；同时利用过表达酪氨酸的反馈抑制调节相关基因DAHP合成酶和分支酸变位酶基因解除底物抑制作用，提高了催化反应的效率，使产物白藜芦醇的产量得到了大幅度提高。
[0006]本专利技术的目的之三在于提供一种以葡萄糖为底物微生物合成白藜芦醇的工程菌株在以葡萄糖为底物生物合成白藜芦醇的生物转化方法。
[0007]上述工程菌中，所述过表达L
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酪氨酸氨解酶、对香豆酰基辅酶A连接酶、白藜芦醇合成酶、DAHP合成酶和分支酸变位酶的方法是将所述L
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酪氨酸氨解酶基因、对香豆酰基辅酶A连接酶基因、白藜芦醇合成酶、DAHP合成酶和分支酸变位酶基因全部置于表达质粒的启动子之后进行表达，通过hp4d启动子启动转录；所述DAHP合成酶和分支酸变位酶基因在表达单拷贝质粒pINA1269中进行表达；所述L
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酪氨酸氨解酶基因、对香豆酰基辅酶A连接酶基因、白藜芦醇合成酶通过表达多拷贝质粒pINA1312和表达多拷贝质粒pINA1292，优选在表达质粒pINA1292中进行表达；
[0008]提供一种以葡萄糖为底物生物合成白藜芦醇的工程菌，所述的工程菌含有L
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酪氨酸氨解酶基因、对香豆酰基辅酶A连接酶基因、白藜芦醇合成酶、DAHP合成酶ARO4
K221L
和分支酸变位酶ARO7
G139S
基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，表达L
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酪氨酸氨解酶、对香豆酰基辅酶A连接酶、白藜芦醇合成酶、DAHP合成酶和分支酸变位酶。
[0009]所述L
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酪氨酸氨解酶基因、对香豆酰基辅酶A连接酶基因和白藜芦醇合成酶来源于异源酶。所述L
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酪氨酸氨解酶基因TAL来源于黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)(FjTAL)；所述4
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香豆跣辅酶A连接酶基因4CL1来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)(At4CL1)；所述白藜芦醇合酶基因VST1来源于葡萄(Vitisvinifera)(VvVST1)；所述DAHP合成酶ARO4
K221L
和分支酸变位酶ARO7
G139S
基因来源于解脂耶氏酵母；其中，ARO4
K221L
为ARO4基因的第221位的赖氨酸突变为亮氨酸；ARO7
G139S
为ARO7基因的第139位的甘氨酸突变为丝氨酸。
[0010]所述L
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酪氨酸氨解酶基因、对香豆酰基辅酶A连接酶基因、白藜芦醇合成酶、DAHP合成酶和分支酸变位酶基因的核苷酸序列是根据解脂耶氏酵母密码子偏爱性进行密码子优化后的序列。
[0011]上述以葡萄糖为底物微生物合成白藜芦醇的工程菌的构建方法，包括以下步骤：
[0012](1)利用PCR技术或酶切方法对载体进行线性化处理，回收产物为线性化载体片段；
[0013]利用特异性引物分别对L
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酪氨酸氨解酶基因、对香豆酰基辅酶A连接酶基因和白藜芦醇合成酶基因进行PCR扩增，回收得到目的片段；
[0014](2)以人工合成的YIARO4
K211L
、YIARO7
G139S
基因为模板，使用Overlap PCR扩增得到融合基因：YIARO4
K211L
‑
YIARO7
G139S
酶切连接后构建得到重组质粒
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YIARO4
K211L
‑
YIARO4
G139S
；
[0015](3)将所得质粒
‑
YIARO4
K211L
‑
YIARO4
G139S
经酶切，线性化后转入解脂耶氏酵母Po1f中，挑取阳性转化子，获得初始工程菌株；
[0016](4)利用DNA连接酶将所述含有L
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酪氨酸氨解酶、对香豆酰基辅酶A连接酶和白藜芦醇合成酶编码基因的目本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以葡萄糖为底物生物合成白藜芦醇的工程菌，其特征在于：所述的工程菌含有L
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酪氨酸氨解酶基因、对香豆酰基辅酶A连接酶基因、白藜芦醇合成酶、DAHP合成酶ARO4
K221L
和分支酸变位酶ARO7
G139S
基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，表达L
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酪氨酸氨解酶、对香豆酰基辅酶A连接酶、白藜芦醇合成酶、DAHP合成酶和分支酸变位酶。2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述L
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酪氨酸氨解酶基因TAL来源于黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)(FjTAL)；所述4
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香豆跣辅酶A连接酶基因4CL1来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)(At4CL1)；所述白藜芦醇合酶基因VST1来源于葡萄(Vitisvinifera)(VvVST1)；所述DAHP合成酶ARO4
K221L
和分支酸变位酶ARO7
G139S
基因来源于解脂耶氏酵母；其中，ARO4
K221L
为ARO4基因的第221位的赖氨酸突变为亮氨酸；ARO7
G139S
为ARO7基因的第139位的甘氨酸突变为丝氨酸。3.权利要求1所述的以葡萄糖为底物微生物合成白藜芦醇的工程菌的构建方法，包括以下步骤：(1)利用PCR技术或酶切方法对载体进行线性化处理，回收产物为线性化载体片段；利用特异性引物分别对L
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酪氨酸氨解酶基因、对香豆酰基辅酶A连接酶基因和白藜芦醇合成酶基因进行PCR扩增，回收得到目的片段；(2)以人工合成的YIARO4
K211L
、YIARO7
G139S
基因为模板，使用Overlap PCR扩增得到融合基因：YIARO4
K211L
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YIARO7
G139S
酶切连接后构建得到重组质粒
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YIARO4
K211L
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YIARO4
G139S
；(3)将所得质粒
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YIARO4
K211L
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YIARO4
G139S
经酶切，线性化后转入解脂耶氏酵母Po1f中，挑取阳性转化子，获得初始工程菌株；(4)利用DNA连接酶将所述含有L
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酪氨酸氨解酶、对香豆酰基辅酶A连接酶和白藜芦醇合成酶编码基因的目的片段与所述线性化载体片段进行连接、转化，得到重组表达载体
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FjTAL、重组表达载体
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At4CL1、重组表达载体
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VvVST1；(5)分别使用特异性引物扩增hp4d
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At4CL1
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XPR2、hp4d
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵云现，姜黎，崔金旺，杨志彬，胡江林，田昊博，刘婵，田俊波，蒋硕生，
申请(专利权)人：河北维达康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：