N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成方法及其应用技术

本发明专利技术提供了N

【技术实现步骤摘要】
N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的生物合成方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程、代谢工程、酶工程、生物信息学、合成生物学
，具体涉及N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的生物合成方法及其应用。

技术介绍

[0002]N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺，属于β
‑
吲哚基丙氨酸衍生物，是由哺乳动物的松果体受到黑暗刺激后产生的一种胺类激素，是生物体内一种重要的抗氧化剂。能够改善动物机体睡眠质量。随着动物年龄的增长，N
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乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的分泌量逐渐下降，从而影响动物的睡眠质量。N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺最早发现于牛松果体中，被认为是一种重要的神经激素，后研究发现N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺在人体内各个器官均有分布并发挥着不同的重要功能，现在越来越多的研究表明N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺除了能够治疗失眠症外，还具有抗氧化、抗衰老、调节免疫、抗癌等多种生理功能。目前，N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的获得主要有生物提取和化学合成两大类。由于动植物中天然存在的N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺含量很少，并且提取原料来源有限，提取成本居高不下，工业应用受到诸多限制。化学合成是目前工业生产N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺中普遍采用的方法，经文献调研发现合成方法大致分为造环和借环合成两大类，需要用到污染且毒性较大的含苯环类物质和催化剂，并且产物分离提纯工艺复杂、耗能大、产物纯度低等问题。
[0003]相比化学合成，生物合成具有对环境友好，能耗低，绿色环保等优点。随着合成生物学的发展，越来越多的化合物实现了生物绿色生产。N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺得生物合成途径为：葡萄糖
→
β
‑
吲哚基丙氨酸
→5‑
羟β
‑
吲哚基丙氨酸
→5‑
羟色胺
→
N
‑
乙酰
‑5‑
羟色胺
→
N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺。
[0004]大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。本专利技术以大肠杆菌出发，通过改造大肠杆菌以实现发酵法高效大规模工业化生产N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题为提供N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺高产菌株、N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的生物合成方法，以实现发酵法高效大规模工业化生产N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]提供一种N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的合成方法，包括以下步骤：
[0008]1)利用所述的合成N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺所有蛋白编码基因或能够表达合成N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺所有蛋白编码基因的重组基因工程菌用于合成N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺，所述的能够表达合成N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺所有蛋白编码基因包括色氨酸羟化途径关键酶TPH2基因；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因和BH4再生关键酶PCD，DHPR基
因；5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸产N
‑
乙酰
‑5‑
羟色胺途径关键酶AANAT、ACS基因，和N
‑
乙酰
‑5‑
羟色胺产N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺途径关键酶COMT、MAT基因；
[0009]2)从1)的体系中分离得到N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺。
[0010]上述合成N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺所有蛋白编码基因表达如下蛋白，所述蛋白是如下任一所述的氨基酸序列：
[0011]a：氨基酸序列由如SEQ ID NO：01
‑
10所示的序列，具体地：色氨酸羟化途径关键酶TPH2氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因氨基酸序列依次如SEQ ID NO：2
‑
4所示，BH4再生关键酶PCD，DHPR的氨基酸序列如SEQ ID NO：5
‑
6所示；5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸产N
‑
乙酰
‑5‑
羟色胺途径关键酶AANAT、ACS的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：7
‑
8所示；N
‑
乙酰
‑5‑
羟色胺产N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺途径关键酶COMT、MAT的核苷酸序列如SEQ ID NO：9
‑
10所示；
[0012]或b：为具有与a所述的各氨基酸序列至少95％以上的序列同一性；
[0013]进一步地，为具有与a所述的氨基酸序列98％以上的序列同一性；更优选为具有与a所述的氨基酸序列99％以上的序列同一性；
[0014]或c：由a所述的各氨基酸序列的C末端和/或N末端取代、添加或缺失一个或几个氨基酸残基而形成；
[0015]进一步地，由a所述的氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1
‑
30个，更优选1
‑
10个，还要优选1
‑
6个，最优选1
‑
3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有所述蛋白的功能的衍生蛋白。
[0016]按上述方案，色氨酸羟化途径关键酶TPH2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因核苷酸序列依次如SEQ ID NO：14
‑
16所示，BH4再生关键酶PCD，DHPR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：17
‑
18所示；5
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：1)利用所述的合成N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺所有蛋白编码基因或能够表达合成N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺所有蛋白编码基因的重组基因工程菌用于合成N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺，所述的能够表达合成N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺所有蛋白编码基因包括色氨酸羟化途径关键酶TPH2基因；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因和BH4再生关键酶PCD，DHPR基因；5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸产N
‑
乙酰
‑5‑
羟色胺途径关键酶AANAT、ACS基因，和N
‑
乙酰
‑5‑
羟色胺产N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺途径关键酶COMT、MAT基因；2)从1)的体系中分离得到N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺。2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：所述合成N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺所有蛋白编码基因表达如下蛋白，所述蛋白是如下任一所述的氨基酸序列：a：氨基酸序列由如SEQ ID NO：01
‑
10所示的序列；或b：为具有与a所述的各氨基酸序列至少95％以上的序列同一性；或c：由a所述的各氨基酸序列的C末端和/或N末端取代、添加或缺失一个或几个氨基酸残基而形成。3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：色氨酸羟化途径关键酶TPH2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因核苷酸序列依次如SEQ ID NO：14
‑
16所示，BH4再生关键酶PCD，DHPR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：17
‑
18所示；5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸产N
‑
乙酰
‑5‑
羟色胺途径关键酶AANAT、ACS基因核苷酸序列序列依次如SEQ ID NO：19
‑
20所示；N
‑
乙酰
‑5‑
羟色胺产N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺途径关键酶COMT、MAT基因核苷酸序列如SEQ ID NO：21
‑
22所示。4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：上述合成N
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺所有蛋白编码基因还包括DDC基因，核苷酸序列为SEQ ID NO：24所示，表达DDC蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO：12所示；或上述合成N
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乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺所有蛋白编码基因还包括DDC和GDH基因，DDC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：24所示，表达DDC蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO：12所示；GDH基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：23所示，表达GDH蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO：11所示。5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：上述合成方法具体为下述两种方法之一：第一合成方法：S1：按照如下方法构建重组基因工程菌：将色氨酸羟化途径关键酶TPH2基因；BH4合成途径关键酶folE，PTPS，SPR基因和BH4再生关键酶PCD，DHPR基因放入同一质粒串连表达；将5
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羟基β
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吲哚基丙氨酸产N
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乙酰
‑5‑
羟色胺途径关键酶AANAT、ACS基因放入同一质粒串连表达；将N
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乙酰
‑5‑
羟色胺产N
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乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺途径关键酶COMT、MAT基因放入同一质粒串连表达；将上述质粒共同转化至宿主细胞中，得到重组基因工程菌；S2：将上述重组基因工程菌用于合成N
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乙酰基
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甲氧基色胺。或第二合成方法：将合成N
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乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺基因分别表达，获得二个以上的重组基因工程菌，经多菌株培养方式，合成N
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乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺。6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于：第一合成方法中：所述的宿主细胞为
大肠杆菌宿主细胞，优选为BL21(DE3)，加强β
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵云现，展全乐，胡江林，
申请(专利权)人：河北维达康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：