【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及一种以5-羟色氨酸为底物生物合成n-乙酰基-5甲氧基色胺的解脂耶氏酵母工程菌、构建及其应用。
技术介绍
1、解脂耶氏酵母是一种典型的非常规酵母，该酵母是严格好氧菌，同时也被认定为gras菌株(generally regard as safe)，由于其具有底物的广谱性、高效分泌蛋白质和生长条件要求低等多种功能，该酵母已经成为目前代谢工程及合成生物学研究中备受关注且极具潜力的非模式微生物底盘细胞之一。
2、n-乙酰基-5甲氧基色胺又名褪黑素(melatonin，mt)，松果体素，存在于细菌、真菌、藻类、植物、昆虫、脊椎动物等多种生物体中，被广泛用于治疗失眠、同时也表现出良好的抗氧化、抗炎、清除自由基等生理活性。mt的生物合成以5-羟基色氨酸作为前体，经3步酶促反应合成：首先5-羟基色氨酸(5-hydroxytryptophan，5-htp)经l-芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic-l-amino-acid decarboxylase)作用生成5-羟基色胺(serotonin，5-ht)，随后血清素n-乙酰基转移酶(seerotonin n-acetyltransferase，snat)将5-羟基色胺催化为n-乙酰-5羟色胺(n-acetylserotonin，nas)，然后由n-乙酰血清素氧甲基转移酶(n-acetylserotonin omethyltransferase，asmt)将n-乙酰-5羟色胺甲基化生成n-乙酰基-5甲氧基色胺。
3、尽管生物合成mt(褪黑素)的方法已
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足而提供一种以5-羟色氨酸为底物生物合成n-乙酰基-5甲氧基色胺的解脂耶氏酵母工程菌、构建及其应用。
2、本专利技术第一方面提供一种以5-羟色氨酸为底物生物合成n-乙酰基-5甲氧基色胺的解脂耶氏酵母工程菌。
3、以5-羟色氨酸为底物生物合成n-乙酰基-5甲氧基色胺的解脂耶氏酵母工程菌，该工程菌中敲除了解脂耶氏酵母的编码吲哚胺2，3-双加氧酶的基因和编码芳香族氨基酸氨基转移酶i的基因，和整合了编码芳香族氨基酸脱羧酶的基因ddc、编码血清素n-乙酰基转移酶的基因snat和编码n-乙酰血清素氧甲基转移酶的基因asmt。
4、按上述方案，编码芳香族氨基酸脱羧酶的基因ddc的核苷酸序列如seq id no.01所示，编码芳香族氨基酸脱羧酶氨基酸序列如seq id no.02所示；编码血清素n-乙酰基转移酶的基因snat的核苷酸序列如seq id no.03所示，编码血清素n-乙酰基转移酶氨基酸序列如seq id no.04所示；编码n-乙酰血清素氧甲基转移酶的基因asmt的核苷酸序列如seqidno.05所示，编码n-乙酰血清素氧甲基转移酶氨基酸序列如seq id no.06所示。
5、本专利技术第二方面提供一种上述以5-羟色氨酸为底物生物合成n-乙酰基-5甲氧基色胺的解脂耶氏酵母工程菌的构建方法，将解脂耶氏酵母的编码吲哚胺2，3-双加氧酶的基因和编码芳香族氨基酸氨基转移酶i的基因敲除，构建含有编码芳香族氨基酸脱羧酶的基因ddc的重组载体、含有编码n-乙酰血清素氧甲基转移酶的基因snat和/或编码n-乙酰血清素氧甲基转移酶的基因asmtde的重组载体，将上述重组载体导入到前述敲除了编码吲哚胺2，30双加氧酶的基因和编码芳香族氨基酸氨基转移酶的基因的解脂耶氏酵母菌中，构建以5-羟色氨酸为底物生物合成n-乙酰基-5甲氧基色胺的解脂耶氏酵母工程菌。
6、按上述方案，利用质粒pina1269构建含有编码芳香族氨基酸脱羧酶的基因ddc的重组载体，利用质粒pina1312构建含有编码n-乙酰血清素氧甲基转移酶的基因asmt，利用质粒pina1269或质粒pina1312构建含有编码血清素n-乙酰基转移酶的基因snat的重组载体。
7、优选地，利用质粒pina1269构建含有编码芳香族氨基酸脱羧酶的基因ddc的重组载体，利用质粒pina1312构建含有编码n-乙酰血清素氧甲基转移酶的基因asmt和编码血清素n-乙酰基转移酶的基因snat的重组载体。
8、按上述方案，所述的解脂耶氏酵母的编码编码吲哚胺2，3-双加氧酶的基因和编码芳香族氨基酸氨基转移酶i的基因的敲除方法为：
9、构建靶向敲除基因的pylcas9质粒；
10、构建敲除基因的敲除片段，解脂耶氏酵母基因组作为模板扩增菌株敲除片段上游同源臂；解脂耶氏酵母基因组作为模板扩增敲除片段下游同源臂，使用overlap的方法构建敲除基因的敲除片段δ敲除基因-fragment；
11、将构建靶向敲除基因的pylcas9-455p质粒和敲除基因的敲除片段进行共转化，构建得到敲除了基因的菌株。
12、具体地，编码吲哚胺2，3-双加氧酶基因的敲除方法为：
13、首先构建靶向yali0f26455p基因的pylcas9-455p质粒，使用455p-sgrna-f/455p-sgrna-r为引物，pylcas9质粒为模板进行扩增，随后使用t5 exo的方法进行质粒的自连，构建得到pylcas9-455p质粒。
14、其次构建yali0f26455p基因的敲除片段，使用del-455p-f1/del-455p-r1为引物，解脂耶氏酵母基因组作为模板扩增菌株敲除片段上游同源臂；使用del-455p-f2/del-455p-r2为引物，解脂耶氏酵母基因组作为模板扩增敲除片段下游同源臂，随后使用del-455p-f1/del-455p-r2为引物，使用overlap的方法构建yali0f26455p基因的敲除片段δ455p-fragment。
15、将pylcas9-455p质粒和δ455p-fragment对po1f菌株进行共转化，菌落pcr筛选，构建得到敲除编码吲哚胺2，30双加氧酶的基因和编码芳香族氨基酸氨基转移酶的基因的ys-01菌株。其中所使用的引物序列如下表所示：
16、 引物名 序列 455p-sgrna-f taccccaggacgaggcggcgttttagagctagaaatagcaagt 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.以5-羟色氨酸为底物生物合成N-乙酰基-5甲氧基色胺的解脂耶氏酵母工程菌，其特征在于：该工程菌中敲除了解脂耶氏酵母的编码吲哚胺2，3-双加氧酶的基因和编码芳香族氨基酸氨基转移酶I的基因，和整合了编码芳香族氨基酸脱羧酶的基因ddc、编码血清素N-乙酰基转移酶的基因SNAT和编码N-乙酰血清素氧甲基转移酶的基因ASMT。
2.权利要求1所述的以5-羟色氨酸为底物生物合成N-乙酰基-5甲氧基色胺的解脂耶氏酵母工程菌的构建方法，其特征在于：将解脂耶氏酵母的编码吲哚胺2，3-双加氧酶的基因和编码芳香族氨基酸氨基转移酶I的基因敲除，构建含有编码芳香族氨基酸脱羧酶的基因ddc的重组载体、含有编码N-乙酰血清素氧甲基转移酶的基因SNAT和/或编码N-乙酰血清素氧甲基转移酶的基因ASMTde的重组载体，将上述重组载体导入到前述敲除了编码吲哚胺2，3-双加氧酶的基因和编码芳香族氨基酸氨基转移酶I的基因的解脂耶氏酵母菌中，构建以5-羟色氨酸为底物生物合成N-乙酰基-5甲氧基色胺的解脂耶氏酵母工程菌。
3.权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌在以5-羟色氨酸为底物生物合成N-乙
...【技术特征摘要】
1.以5-羟色氨酸为底物生物合成n-乙酰基-5甲氧基色胺的解脂耶氏酵母工程菌，其特征在于：该工程菌中敲除了解脂耶氏酵母的编码吲哚胺2，3-双加氧酶的基因和编码芳香族氨基酸氨基转移酶i的基因，和整合了编码芳香族氨基酸脱羧酶的基因ddc、编码血清素n-乙酰基转移酶的基因snat和编码n-乙酰血清素氧甲基转移酶的基因asmt。
2.权利要求1所述的以5-羟色氨酸为底物生物合成n-乙酰基-5甲氧基色胺的解脂耶氏酵母工程菌的构建方法，其特征在于：将解脂耶氏酵母的编码吲哚胺2，3-双加氧酶的基因和编码芳香族...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴元庆，杨志斌，李迪，张倚霞，胡江林，
申请(专利权)人：河北维达康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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