【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及工业微生物发酵，具体涉及一种青霉菌及其发酵产atpenina5的方法。
技术介绍
1、atpenin a5是一种有效的复合物ii(琥珀酸-泛醌氧化还原酶) 抑制剂，复合物ii是线粒体电子传递链上重要功能复合物，已经成为农用杀菌剂方面的关键靶标，该类杀菌剂在植物病原真菌保护中发挥着重要的作用。基于复合物ii的呼吸系统抑制剂被广泛用于世界范围内的真菌病害，该类抑制剂通过与复合物ii的泛醌还原位点结合而抑制真菌的呼吸，作用方式独特，与其他类别的杀菌剂如苯并咪唑类、strobilurins类、氨基吡啶类均无交互抗性，因此成为改善杀菌剂抗性和提高病害控制的优秀候选品种。
2、1988年，由日本kitasato公司从土壤中分离得到的一株菌株 penicilliumsp.fo-125的代谢产物中分离获得。atpenin a5是一种胞内脂溶性抗真菌类抗生素，在筛选脂代谢微生物抑制剂的过程中， hidetoshi kumagai等发现了从青霉菌fo-125的培养液中分离到一系列抗真菌抗生素atpenins，包含三种有效组分，a4,a5和b，他们都具有抗真菌活性，尤其是对trichophyton sp.真菌的抑制能力最强，其中又以atpenin a5的抗真菌活性最强。
3、masaki ohtaw等，enantioselective total synthesis of atpenin a5，报道了atpenin a5具有比较出众的活性，对其进行了全合成研究，也完成了合成产物的结构确证。但化学合成存在反应步骤长
4、针对现有技术中发酵获得atpenin a5存在发酵产量低，而化学合成制备工艺中存在的合成步骤长、收率低，且用到的试剂易燃易爆，较不安全等一系列的问题，因此，本专利技术寻求一种新的微生物，并可通过简单的发酵即可获得较高发酵产量的atpenin a5，从而实现 atpenin a5较低的生产成本。
技术实现思路
1、为了解决atpenin a5现有制备方法不足的问题，本专利技术的目的之一在于提供一种青霉菌(penicillium sp.)hdcc00055保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为 cgmcc no.23056，保藏日期为2021年07月26日，并登记在册，证明存活。
2、本专利技术的目的还在于提供了一种青霉菌(penicillium sp.)hdcc00055在制备atpenin a5或者含有atpenin a5的药物组合物的应用。
3、本专利技术还提供了一种atpenin a5的制备方法，该包括采用青霉菌 (penicilliumsp.)hdcc00055在含有可同化的碳源和/或氮源的营养培养基里，进行有氧发酵。
4、在优选的实施方案中，所述可同化的碳源选自葡萄糖、甘油、山梨醇、蔗糖、麦芽糖、糊精、淀粉之一或者任意几种的组合，优选葡萄糖、甘油、山梨醇。
5、在优选的实施方案中，所述可同化的氮源选自黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米蛋白粉、玉米粉、小麦胚芽粉、酵母浸粉、蛋白胨、酵母膏、玉米浆之一或者任意几种的组合；优选为黄豆饼粉、棉籽饼粉。
6、在优选的实施方案中，所述营养培养基还包括无机盐，所述无机盐选为硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、氯化钙之一或任意几种的组合。
7、在优选的实施方案中，所述营养培养基含有：
8、葡萄糖0～4％
9、山梨醇1～9％
10、淀粉0～3％
11、酵母浸粉0～3％
12、蛋白胨0～3％
13、硫酸铵0～1.5％
14、磷酸二氢钾0.1～0.5％
15、硫酸镁0.05～0.2％
16、氯化钾0.05～0.15％
17、氯化钙0.05～0.15％
18、在优选的实施方案中，所述有氧发酵的温度为23～30℃，优选25～27℃；培养基ph为5.0～7.0，优选为5.0～6.0；培养时间为96～144 小时，优选为96～120小时；通气量为0.5～1.2vvm，优选为0.8～1.0vvm。
19、在优选的实施方案中，所述青霉菌(penicillium sp.)hdcc00055 是通过种子液接种至所述营养培养基中进行所述发酵培养的；
20、其中，所述种子液是将权利要求1所述的青霉菌(penicillium sp.)hdcc00055在种子培养基里进行种子培养得到的。
21、在优选的实施方案中，所述的种子培养基含有：
22、葡萄糖2～6％
23、硫酸铵0.8～1.5％
24、磷酸二氢钾0.02～0.1％
25、硫酸镁0.02～0.1％
26、在优选的实施方案中，所述种子培养的条件为：种子培养的温度为23～30℃，优选25～27℃；培养基ph为5.0～7.0，优选为5.0～6.0；培养时间为24～72小时，优选为30～40小时。
27、在优选的实施方案中，所述的种子培养液，移种时的关键控制指标 ph为2.5～4.0。
28、本专利技术atpenin a5通过以下条件进行hplc检测：
29、本专利技术atpenin a5效价检测所用的液相检测方法条件如下：
30、hplc检测方法为：
31、色谱柱：c18 4.6*250mm 5um
32、柱温：35℃
33、进样量：5ul
34、流动相：a(水)：b(0.1％甲酸乙腈溶液)＝65：35
35、流速：1.0ml/min。
36、本专利技术所述青霉菌(penicillium sp.)hdcc00055(cgmcc no.23056)主要生物学特征为：菌落正圆形，边缘整齐，中心孢子丰满，表面呈墨绿色，边缘为白色气生菌丝、微凸，反面浅黄色，无渗出液，无可溶性色素。显微镜下观察，该菌种菌丝粗、网状、顶端产生多细胞的分生孢子梗，分生孢子呈现扫帚状，染色较好。
37、本专利技术所述菌株青霉菌(penicillium sp.)hdcc00055(cgmcc no.23056)为一株全新的atpenin a5产生菌，生产能力高，其发酵积累atpenin a5的能力比现有技术中其他菌种有了大幅度的提高， atpenin a5的效价可达314mg/l以上，便于工业化生产。
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1.一种青霉菌(Penicillium sp.)HDCC00055保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.23056，保藏日期为2021年07月26日。
2.根据权利要求1所述的青霉菌(Penicillium sp.)HDCC00055在制备Atpenin A5或者含有Atpenin A5的药物组合物的应用。
3.一种含权利要求1所述的青霉菌(Penicillium sp.)HDCC00055的发酵液。
4.一种Atpenin A5的制备方法，其特征在于：包括采用如权利要求1所述的青霉菌(Penicillium sp.)HDCC00055进行发酵制备。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的发酵过程包括在含有可同化的碳源和/或氮源的营养培养基里，进行有氧发酵。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述可同化的碳源选自葡萄糖、甘油、山梨醇、蔗糖、麦芽糖、糊精、淀粉之一或者任意几种的组合，优选葡萄糖、淀粉、山梨醇。
7.根据权利要求5所述的方法，
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述营养培养基还包括无机盐，所述无机盐为硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、氯化钙中的一种或任意几种的组合。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述营养培养基含有：葡萄糖0～4％、山梨醇1～9％、淀粉0～3％、酵母浸粉0～3％、蛋白胨0～3％、硫酸铵0～1.5％、磷酸二氢钾0.1～0.5％、硫酸镁0.05～0.2％、氯化钾0.05～0.15％、氯化钙0.05～0.15％。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述有氧发酵的温度为23～30℃，优选25～27℃；培养基pH为5.0～7.0，优选为5.0～6.0；培养时间为96～144小时，优选为96～120小时；通气量为0.5～1.2vvm，优选为0.8～1.0vvm。
11.根据权利要求4-10任一项所述的方法，其特征在于：所述青霉菌(Penicilliumsp.)HDCC00055是通过种子液接种至所述营养培养基中进行所述发酵培养的；
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述的种子培养基含有葡萄糖2～6％、硫酸铵0.8～1.5％、磷酸二氢钾0.02～0.1％、硫酸镁0.02～0.1％。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述种子培养的条件为：种子培养温度为23～30℃，优选25～27℃；培养基pH为5.0～7.0，优选为5.0～6.0；培养时间为24～72小时，优选为30～40小时。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述的种子培养液，移种时的关键控制指标pH为2.5～4.0。
...【技术特征摘要】
1.一种青霉菌(penicillium sp.)hdcc00055保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.23056，保藏日期为2021年07月26日。
2.根据权利要求1所述的青霉菌(penicillium sp.)hdcc00055在制备atpenin a5或者含有atpenin a5的药物组合物的应用。
3.一种含权利要求1所述的青霉菌(penicillium sp.)hdcc00055的发酵液。
4.一种atpenin a5的制备方法，其特征在于：包括采用如权利要求1所述的青霉菌(penicillium sp.)hdcc00055进行发酵制备。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的发酵过程包括在含有可同化的碳源和/或氮源的营养培养基里，进行有氧发酵。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述可同化的碳源选自葡萄糖、甘油、山梨醇、蔗糖、麦芽糖、糊精、淀粉之一或者任意几种的组合，优选葡萄糖、淀粉、山梨醇。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述可同化的氮源选自黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米蛋白粉、玉米粉、小麦胚芽粉、酵母浸粉、蛋白胨、酵母膏、玉米浆之一或者任意几种的组合；优选为黄豆饼粉、棉籽饼粉之一或者任意几种的组合。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述营养培养基还包括无机盐，所述无机盐为硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱进伟，彭湘屏，郑玲辉，詹佩君，张敏，石磊，孙琼，汪超，
申请(专利权)人：浙江珲达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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