一种DidemninB的分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种从发酵液中分离纯化Didemnin B的方法，该方法通过将发酵液絮凝、分离、浸提、大孔吸附树脂富集、树脂层析、液相制备、结晶等，可将初始发酵液中色谱纯度仅有5％

【技术实现步骤摘要】
一种Didemnin B的分离纯化方法


[0001]本专利技术属于药物分析领域，具体地，涉及一种从微生物发酵液中分离纯化Didemnin B的方法及应用。

技术介绍

[0002]1981年，Rinehart等在《Journal of American Chemical Society》上发表文献，报道了其从加勒比海被囊动物中发现的一类新型双烯类海洋化合物Didemnin B，它具有环状二肽的新颖结构，并且具有很强的抗肿瘤活性，可通过抑制肿瘤细胞RNA和DNA的复制以及肿瘤细胞蛋白质的合成来起到抗肿瘤作用的。
[0003]1989年，Yasumasa Hamada等于在《Journal of American Chemical Society》发表名为《Efficient Total Synthesis of Didemnins A and B》的文献，介绍了Didemnin B的全合成方法，简单提到了他们所使用的分离纯化方法，即：乙酸乙酯萃取，碳酸氢钠洗涤，无水硫酸钠干燥，结晶和硅胶层析。
[0004]2011年，Moriya Tsukimoto等在《Journal of Natural Products》发表了一篇名为《Bacterial Production of the Tunicate
‑
Derived Antitumor Cyclic Depsipeptide Didemnin B》的报道，介绍了微生物发酵合成Didemnin B，其中包含从发酵液中分离纯化Didemnin B的方法，因其发酵液中添加了促进微生物生长的树脂，有效组分吸附在了树脂上，需先将树脂分离出来，然后使用甲醇洗脱树脂，再使用乙酸乙酯萃取，再浓缩上硅胶柱，最后通过反相制备得到成品。该方案中使用了硅胶层析，一次性硅胶成本较高，环保压力较大，不适于工业生产。
[0005]JP2012240974A公开了一种生产Didemnin B的方法，该方法使用了运动型Citrella mobilis菌，并从培养物中收集Didemnin B。具体地，实施例1公开了使用乙酸乙酯和水萃取两次再浓缩的初级分离方法。
[0006]考虑到工业应用对生产成本和环境保护以及工业成品对纯度和收率的要求，现阶段仍然需要开发一种利于工业应用的从发酵液中分离纯化Didemnin B的方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了一种Didemnin B的分离纯化方法，该方法可以将Didemnin B从发酵液中提取纯化，获得收率大于40％、色谱纯度大于95％的Didemnin B成品。
[0008]本专利技术方法包括步骤(a)：将含Didemnin B的发酵液进行絮凝后固液分离，保留滤饼。具体地，步骤(a)中所述絮凝剂选自阳离子聚丙烯酰胺，Al2(SO4)3·
18H2O，Na2HPO4·
12H2O，CaCl2，Fe2(SO4)3中的一种或几种，优选阳离子聚丙烯酰胺；所述的絮凝剂的加入量至少以所述的含Didemnin B的发酵液不再絮凝为止。
[0009]进一步地，步骤(a)中絮凝剂为0.1
‰
～3
‰
的阳离子聚丙烯酰胺溶液，优选2
‰
的阳离子聚丙烯酰胺溶液；絮凝剂添加体积为发酵液体积的30％～70％，优选50％。
[0010]本专利技术所述的Didemnin B的分离纯化方法，还包括下述步骤中的一步或几步：
[0011](b)将步骤(a)所得滤饼用有机试剂浸提；
[0012](c)将步骤(b)所得浸提液用大孔吸附树脂富集，收集洗脱液浓缩；
[0013](d)将步骤(c)所得浓缩物进行树脂层析，收集洗脱液浓缩；
[0014](e)使用制备液相色谱仪将步骤(d)浓缩物层析；
[0015](f)结晶。
[0016]其中，步骤(d)得到的浓缩物可以用乙酸乙酯萃取后再进行步骤(e)。
[0017]具体地，步骤(b)所述有机溶剂为醇类试剂，优选乙醇；所述醇类与滤饼体积重量比(mL:g)优选2:1～5:1，更优选为3:1。
[0018]具体地，步骤(c)中所述大孔吸附树脂型号选自AB
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8，D101,X
‑
5，HPD
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400，LX
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T81，优选LX
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T81树脂；优选方案中LX
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T81树脂富集中的洗脱剂为乙醇和水，乙醇和水的体积比为60％～95％，优选95％。
[0019]具体地，步骤(d)中所述层析树脂粒径是0.1
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0.3mm，孔径600nm；优选LX
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60S树脂、LX
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30S树脂、PRP
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512A树脂，更优选地为PRP
‑
512A树脂；
[0020]进一步，步骤(d)中所述层析树脂为PRP
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512A树脂，层析上柱量为2g/L～6g/L，优选5g/L；PRP
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512A树脂层析时洗脱剂为乙醇和水，乙醇水的体积比为70％～95％，优选85％。
[0021]具体地，步骤(e)中使用的制备液相色谱仪使用填料为C18填料，步骤(e)中制备液相色谱仪使用的流动相为乙腈和水，其中乙腈和水的体积比为3:7～6:4，优选5:5；优选地，制备液相上柱量为1g/L～5g/L，优选3g/L。
[0022]具体地，步骤(f)中加入乙酸乙酯溶解配制成结晶前液，所述结晶前液浓度在100g/L～300g/L，优选200g/L；所述结晶前液滴加正己烷后过滤可得结晶湿品，干燥即得成品。
[0023]本专利技术所述含Didemnin B发酵液为运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)利用可同化的碳源、氮源及无机盐进行有氧发酵过程所得。具体地，所述运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)为HDCC00053，所述菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.22003，保藏日期为2021年3月12日。
[0024]本专利技术还提供了通过上述Didemnin B的分离纯化方法获得的Didemnin B，所述Didemnin B纯度大于95％。
[0025]本专利技术的有益效果：
[0026]本专利技术公开了一种从发酵液中分离纯化Didemnin B的方法，该方法通过将发酵液絮凝、分离、浸提、大孔吸附树脂富集、树脂层析、使用液相制备、结晶等，可将初始发酵液中色谱纯度仅有5％
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15％的Didemnin B纯化成最终色谱纯度大于95％、收率大于40％的成品，从而实现产业化。
附图说明：
[0027]图1为实施例1中初始发酵液的HPLC图谱
[0028]图2为实施例1中Didemnin B成品的HPLC图谱
具体实施方式：
[0029本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Didemnin B的分离纯化方法，该方法包括步骤(a)：将含Didemnin B的发酵液进行絮凝后固液分离，保留滤饼。2.如权利要求1所述的Didemnin B的分离纯化方法，其特征在于，步骤(a)中所述絮凝剂选自阳离子聚丙烯酰胺，Al2(SO4)3·
18H2O，Na2HPO4·
12H2O，CaCl2，Fe2(SO4)3中的一种或几种，优选阳离子聚丙烯酰胺；所述的絮凝剂的加入量至少以所述的含Didemnin B的发酵液不再絮凝为止；进一步，步骤(a)中絮凝剂为0.1
‰
～3
‰
的阳离子聚丙烯酰胺溶液，优选2
‰
的阳离子聚丙烯酰胺溶液；絮凝剂添加体积为发酵液体积的30％～70％，优选50％。3.如权利要求1或2所述的Didemnin B的分离纯化方法，其特征在于，该方法包括：(b)将步骤(a)所得滤饼用有机试剂浸提；(c)将步骤(b)所得浸提液用大孔吸附树脂富集，收集洗脱液浓缩；(d)将步骤(c)所得浓缩物进行树脂层析，收集洗脱液浓缩；(e)使用制备液相色谱仪将步骤(d)浓缩物层析；(f)结晶。4.如权利要求3所述的Didemnin B的分离纯化方法，其特征在于，取步骤(d)得到的浓缩物用乙酸乙酯萃取后再进行步骤(e)。5.如权利要求3所述的Didemnin B的分离纯化方法，其特征在于，步骤(b)所述有机溶剂为醇类试剂，优选乙醇；所述醇类与滤饼体积重量比(mL:g)优选2:1～5:1，更优选为3:1。6.如权利要求3所述的Didemnin B的分离纯化方法，其特征在于，步骤(c)中所述大孔吸附树脂型号选自AB
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8，D101,X
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5，HPD
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400，LX
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T81，优选LX
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T81树脂；优选方案中LX
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T81树脂富集中的洗脱剂为乙醇和水，乙醇和水的体积比为60％～95％，优选95％。7.如权利要求3所述的Didemnin B的分离纯化方法，其特征在于，步骤(d)中所述层析树脂...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱进伟，石磊，郑玲辉，彭湘屏，张敏，高祥，陈世敏，汪超，
申请(专利权)人：浙江珲达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：