以β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了以β

【技术实现步骤摘要】
以
β
‑
吲哚基丙氨酸为底物合成5
‑
羟基
β
‑
吲哚基丙氨酸的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种以β
‑
吲哚基丙氨酸为底物合成5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸的方法及其应用。

技术介绍

[0002]5‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸广泛存在于豆科植物的种子中，其中非洲植物加纳的种子中含量最高。从加纳籽中提取和精制5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸的基本工艺路线为：加纳籽粉碎—萃取—过滤离心—物理脱色—真空浓缩—结晶、重结晶—真空干燥。但随着非洲加纳树数量不断减少，传统提取法获得5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸变得越来越困难，作为人体神经代谢途径中抵抗抑郁、缓解情感性精神障碍的天然药物，近年来5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸的市场需求越来越大，依靠天然产物提取己难以满足市场需求，越来越多的企业开始从化学合成与生物发酵等方面研究5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸的生产。
[0003]目前所报道的生物合成5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸的合成方法，大部分是先合成β
‑
吲哚基丙氨酸后再羟化其生成5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸。β
‑
吲哚基丙氨酸的生物合成方法目前已比较成熟。但是β
‑
吲哚基丙氨酸羟化生成5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸需要有BH4为辅因子参与才能进行，而BH4难以储存且价格昂贵，这使得通过额外添加BH4以工业化生产5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸成为不可能。
[0004]而微生物中又没有BH4的合成路径，要想在微生物中合成则必须通过外源基因的加入。本专利技术通过对工程菌的BH4合成和再生能力的加强，并通过双BH4再生系统的应用，提高了5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸的产量。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题为提供5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸高产菌株、构建以及以β
‑
吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸的方法。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]提供一种以β
‑
吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸的方法，包括以下步骤：
[0008]1)利用所述的合成5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸蛋白编码基因或能够表达合成β
‑
吲哚基丙氨酸蛋白编码基因的重组基因工程菌，以β
‑
吲哚基丙氨酸为底物，生物发酵合成5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸，所述的能够表达合成5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸蛋白编码基因包括β
‑
吲哚基丙氨酸产5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸途径关键酶基因TPH2；BH4合成基因FOLE、PTPS、SPR；BH4再生酶基因包括PCD基因、qBH2产BH4再生酶基因QDPR和BH2产BH4再生酶基因DHFR；
[0009]2)从1)的体系中分离得到5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸。
[0010]按上述方案，PCD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，qBH2产BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:6
‑
10中任一序列所示；BH2产BH4再生酶基因DHFR的核苷酸
序列如SEQ ID NO:11
‑
15中任一序列所示。
[0011]优选地，所述BH2产BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:6，和SEQ ID NO:8中任一序列所示；BH2产BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14中任一序列所示。
[0012]更优选地，所述BH2产BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；BH2产BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
[0013]按上述方案，β
‑
吲哚基丙氨酸产5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸途径关键酶基因TPH2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0014]BH4合成途径关键酶基因FOLE、PTPS、SPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:2
‑
4所示。
[0015]按上述方案，所述的步骤1)为将所构建的重组菌经过活化培养后，转接至发酵培养基诱导表达后，以β
‑
吲哚基丙氨酸为底物转化生成5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸。
[0016]具体的，上述方法为：将所构建的重组基因工程菌分别经过LB培养基活化培养后，得到种子液，将种子液转接至发酵培养基，发酵后加入IPTG诱导，并加入β
‑
吲哚基丙氨酸，发酵转化生成5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸。
[0017]进一步地，所述种子液OD600＝5；
[0018]所述种子培养基(质量百分比)为1％胰蛋白胨、1％氯化钠和0.5％酵母提取物；
[0019]所述种子液的培养条件为28
‑
40℃，160
‑
230rpm，优选为37℃，225rpm；
[0020]所述种子液接入发酵培养基的比例为1％
‑
10％，优选比例为2％；
[0021]所述发酵培养基的组成(质量百分比)为：1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、0.5％甘油、0.231％KH2PO4和1.64％K2HPO4·
3H2O；
[0022]所述进行诱导前的发酵时间为1
‑
5h，优选为2h；
[0023]所述IPTG的终浓度为0.1
‑
10mM，优选为1mM；
[0024]所述诱导表达的条件为16
‑
37℃，优选为30℃；
[0025]所述反应体系β
‑
吲哚基丙氨酸浓度为1
‑
50g/L，优选10g/L；
[0026]所述发酵时间为18
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以β
‑
吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)利用所述的合成5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸蛋白编码基因或能够表达合成β
‑
吲哚基丙氨酸蛋白编码基因的重组基因工程菌，以β
‑
吲哚基丙氨酸为底物，生物发酵合成5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸，所述的能够表达合成5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸蛋白编码基因包括β
‑
吲哚基丙氨酸产5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸途径关键酶基因TPH2；BH4合成基因FOLE、PTPS、SPR；BH4再生酶基因包括PCD基因、qBH2产BH4再生酶基因QDPR和BH2产BH4再生酶基因DHFR；2)从1)的体系中分离得到5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：PCD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，qBH2产BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:6
‑
10中任一序列所示；BH2产BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:11
‑
15中任一序列所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述BH2产BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8中任一序列所示；BH2产BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14中任一序列所示。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述BH2产BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；BH2产BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：β
‑
吲哚基丙氨酸产5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸途径关键酶基因TPH2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；BH4合成途径关键酶基因FOLE、PTPS、SPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:2
‑
4所示。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤1)为将所构建的重组菌经过活化培养后，转接至发酵培养基诱导表达后，以β
‑
吲哚基丙氨酸为底物转化生成5
‑
羟基β
‑
吲哚基丙氨酸。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：上述方法为：将所构建的重组基因工程菌分别经过LB培养基活化培养后，得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵云现，杨志彬，胡江林，崔金旺，赵凯，展全乐，
申请(专利权)人：河北维达康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：