高产L-亮氨酸的基因工程菌及其发酵法制造L-异亮氨酸的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用发酵法以更高收率廉价制造L

【技术实现步骤摘要】
高产L
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亮氨酸的基因工程菌及其发酵法制造L
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异亮氨酸的应用


[0001]本专利技术属于生化工程领域，涉及一种高产L
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亮氨酸的基因工程菌及其构建方法，以及应用该菌种发酵生产L
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异亮氨酸的方法。

技术介绍

[0002]L
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异亮氨酸又称“L
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异白氨酸”，属于支链氨基酸(branched chain amino acid，BCAA)，是人与动物自身不能合成而必需以来外源供给的八大必需氨基酸之一，具有多种生理功能，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质生成和抑制其分解的效果，在人体生命活动中起着重要作用，因此在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。
[0003]L
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异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三种，而目前在工业生产上实施的只有发酵法。发酵法是利用微生物的代谢作用，生物合成并过量积累L
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异亮氨酸的的方法，包括添加前体发酵法和直接发酵法两类。其中添加前体发酵法又称微生物转化法，这种方法使用葡萄糖作为发酵碳源、能源，在添加特异的前体物质以避免氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，经微生物作用将其有效的转化为目的氨基酸。对于L
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异亮氨酸，其前体物质主要有α
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氨基丁酸、α
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羟基丁酸、α
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酮基丁酸和D
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苏氨酸等，采用的微生物主要有芽孢杆菌、假单胞菌或粘质赛氏杆菌等。直接发酵法借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性变异株，以解除代谢调解中的反馈抑制与阻遏，达到过量积累某种氨基酸的目的。目前L
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异亮氨酸产生菌大多由谷氨酸产生菌(黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌等)诱变选育而来。此外以L
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异亮氨酸生物合成的关键酶——苏氨酸脱氨酶或其乙酰羟基酸合酶通过重组DNA技术而增强的埃希氏杆菌属或棒状杆菌属的微生物也可作为L
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异亮氨酸生产菌株。
[0004]L
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异亮氨酸的生物合成途径包括：葡萄糖经酵解途径生成磷酸烯醇式丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸经二氧化碳固定反应生成四碳二羧酸，后经氨基化反应生成天冬氨酸；天冬氨酸在天冬氨酸激酶催化作用下，生成天冬氨酸半醛；天冬氨酸半醛在高丝氨酸脱氢酶的催化下，生成高丝氨酸；高丝氨酸在高丝氨酸激酶的催化作用下生成苏氨酸；苏氨酸经苏氨酸脱氨酶(ilvA)或苏氨酸脱水酶tdcB、乙酰化羟基酸合成酶(ilvIH、ilvBN、ilvGM、alsS)和支链氨基酸谷氨酸转氨酶或脱氢酶的催化作用，生成异亮氨酸。另外，外源苏氨酸也可以经苏氨酸转运蛋白tdcC运进细胞内，用于合成异亮氨酸。而胞内合成的异亮氨酸可以经大肠杆菌外运蛋白ygaZH或来自谷氨酸棒杆菌的外运蛋白brnEF排出细胞。
[0005]目前，国内已有多家企业通过发酵法进行L
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异亮氨酸的生产，但仍存在菌株产酸水平低，发酵产物提取技术差等问题。因此，改进L
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异亮氨酸的发酵菌株及技术工艺，提高产酸水平，进而降低提取难度，对提高国内L
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异亮氨酸的产量及产品市场竞争力具有重要意义。

技术实现思路

[0006]有鉴于苏氨酸的供给直接影响L
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异亮氨酸的合成，因此，本专利技术要解决的技术问题在于提供新型的基因工程菌株，通过添加苏氨酸的培养基培养该基因工程菌朱以实现高产L
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异亮氨酸的方法。
[0007]本专利技术所提供的具有L
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异亮氨酸生产性的埃希氏杆菌属细菌的特征是保留含有编码实质上解除了L
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异亮氨酸的抑制的解除型ilvA基因或苏氨酸脱水酶tdcB基因和含有编码实质上解除了L
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异亮氨酸的抑制的乙酰化羟基酸合成酶的解除型(ilvIH、ilvBN，ilvGM，alsS)基因，以及异亮氨酸转运蛋白tdcC，以实现合成异亮氨酸所需的前体2
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氧代丁酸的充分供应。
[0008]胞内的2
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氧代丁酸与丙酮酸通过乙酰羟酸异构酶(ilvC)、二羟酸脱水酶(ilvD)、支链氨基酸氨基转移酶(ilvE)/支链氨基酸脱氢酶(leuDH)的处理后，合成异亮氨酸。然后经过支链氨基酸转出蛋白ygaZH或brnEF运出细胞。其中ilvC可以为野生型的ilvC或突变版本的ilvCm，上述基因可以被保持在非染色体DNA或染色体DNA上。
[0009]本专利技术还提供了用发酵法制造L
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异亮氨酸的方法，其特征是在培养基中添加苏氨酸，培养上述埃希氏杆菌属细菌，使L
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异亮氨酸在该培养基中生成积累，而后从该培养基中提取出L
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异亮氨酸。
具体实施方式
[0010]I.定义
[0011]在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
[0012]也应理解本文使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的，并不意欲是限制性的。
[0013]本文中使用冠词“一”和“所述”来指代冠词的语法宾语中的一个或多于一个。
[0014]替代方案(例如，“或”)的使用应当被理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。术语“和/或”应当被理解为意指替代方案中的一个或两个。
[0015]如本文使用的和除非另作说明，术语“大约”指的是可测量的值诸如量、时间期间等时，表示包括从给定值
±
10％的变化，更优选
±
5％，甚至更优选
±
1％，和还要更优选
±
0.1％的变化，只要这种变化适于实施公开的方法。
[0016]如本文所用，术语“基因合成”，指利用重组DNA技术产生或利用本领域可用和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
[0017]“编码”指的是多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特异性序列用作模板合成在生物学过程中的其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于那个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的编码链，和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链两者，都可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其
他产物。
[0018]如本文所用，术语“内源的”指的是来本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产异亮氨酸的方法，其特征在于，采用基因工程的方法获得工程菌株，所述工程菌株具有比野生型菌株高30％以上的乙酰化羟基酸合成酶(acetohydroxyacid synthase)的活性。2.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述工程菌株可以是微生物或其他生物包括但不限于野生或者基因工程改造过的大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、酵母(Yeast)、棒杆菌(Corynebacterium)或链霉菌(Streptomyces)等。3.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，编码乙酰化羟基酸合成酶的多核苷酸序列包括来源于微生物或其他生物的野生或者基因工程改造过的ilvIH、alsS、ilvGM或ilvBN基因。4.如权利要求1所述的基因工程的方法，包括质粒表达，基因组整合如CRISPR，lambda red等介导的同源重组等。5.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株含有的乳酸脱氢酶ldhA及醇脱氢酶adhE活性分别或同时被减弱或消除。6.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株含有丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase)活性分别或同时被减弱或消除。7.权利要求1所述的工程菌株在制备L
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异亮氨酸中的用途。8.一种生产L
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异亮氨酸的方法，其特征在于，包括步骤：(i)在氧气不充分的培养条件下，培养权利要求5所述的工程菌株；加入二酮丁酸或者苏氨酸、富马酸、天冬氨酸、高丝氨酸、丙酸等可以转化为二酮丁酸的原料。(ii)从(i)的培养物中分离出所述的L
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异亮氨酸。9.一种生产L
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异亮氨酸的方法，其特征在于，包括步骤：(i)在氧气充分的培养条件下，培养权利要求6所述的工程菌株；加入二酮丁酸或者苏氨酸、...

【专利技术属性】
技术研发人员：张科春，王靖宇，王吉龙，
申请(专利权)人：西湖大学，
类型：发明
国别省市：