一种全细胞催化制备4-羟基异亮氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种全细胞催化制备4

【技术实现步骤摘要】
一种全细胞催化制备4
‑
羟基异亮氨酸的方法


[0001]本专利技术涉及一种全细胞催化制备4
‑
羟基异亮氨酸的方法，属于生物


技术介绍

[0002]4‑
羟基异亮氨酸((2S,3R,4S)
‑4‑
hydroxyisoleucine,4
‑
HIL)是一种新型胰岛素分泌促进剂，可用于治疗Ⅱ型糖尿病。L
‑4‑
羟基异亮氨酸是存在于胡芦巴属植物中的一种非蛋白氨基酸，这种氨基酸主要存在于胡芦巴种子中，约占该种子中游离氨基酸总含量的80％。传统中药胡芦巴应用于治疗晚期糖尿病、消化不良、胃溃疡、消化紊乱、肿瘤、痛经、体虚、过敏、神经衰弱、痛风和关节炎等。
[0003]除了从葫芦巴种子中提取分离，4
‑
HIL的合成方法主要有化学
‑
酶法和酶催化法。L
‑
异亮氨酸羟化酶(L
‑
isoleucine dioxygenase,IDO)能够特异性催化异亮氨酸生成(2S,3R,4S)
‑4‑
HIL。化学
‑
酶法合成4
‑
HIL的步骤复杂，中间副产物多且转化效率较低。以表达L
‑
异亮氨酸羟化酶的基因工程菌催化异亮氨酸合成4
‑
HIL，转化率还比较低，且后续的分离纯化效率低。

技术实现思路

[0004][技术问题][0005]本专利技术要解决的技术问题是现有的化学
‑
酶法合成4
‑
HIL时，步骤复杂、转化效率低。
[0006][技术方案][0007]本专利技术提供了一种利用全细胞催化法制备4
‑
HIL的方法，所述全细胞是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主、以pET28a为载体表达异亮氨酸双加氧酶，以异亮氨酸为底物构建全细胞催化体系进行转化反应，将转化液进行超滤、离子交换后，再经脱色、浓缩、干燥得到4
‑
HIL产品。
[0008]所述异亮氨酸双加氧酶可以选择来源于枯草芽孢杆菌的异亮氨酸双加氧酶。
[0009]所述方法包括以下步骤：
[0010](1)对重组大肠杆菌进行发酵培养，收集得到菌体；
[0011](2)将菌体细胞、底物、缓冲液混合，于28
‑
32℃条件下，转化20
‑
24h，得到转化液；转化体系中，菌体细胞的浓度是120
‑
180g/L，异亮氨酸的浓度是80
‑
100g/L、α
‑
酮戊二酸的浓度是80
‑
120g/L、Vc的浓度是8
‑
12g/L、七水合硫酸亚铁0.3
‑
1.0g/L；Vc作为还原剂，七水合硫酸亚铁作为辅因子；
[0012](3)将转化液利用超滤膜进行超滤处理以除去蛋白与菌体，得到超滤膜清液；
[0013](4)对清液进行离子交换处理，采用的离子交换柱是732阳离子交换树脂，并用1
‑
2％的氢氧化钠溶液进行洗脱；洗脱液的折光≥0.1时开始收集，收集电导率≤1000us/cm的洗脱液；
[0014](6)向洗脱液中添加12
‑
15％的活性炭，于55
‑
60℃脱色30min
‑
60min，抽滤、浓缩，
干燥得到4
‑
HIL产品。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，称取异亮氨酸90g、α
‑
酮戊二酸100.5g、Vc10.6g、七水合硫酸亚铁0.45g，加自来水溶解，倒入5L发酵罐中，调节料液pH至7.0，加入离心后菌体用量150g，自来水补足至3L，加入泡敌0.5mL，转化条件：30℃，250rpm，1vvm通气量反应，反应24h。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，称取异亮氨酸85g、α
‑
酮戊二酸100g、Vc 9g、七水合硫酸亚铁0.4g，加自来水溶解，倒入5L发酵罐中，调节料液pH至7.0，加入离心后菌体用量130g，自来水补足至3L，加入泡敌0.5ml，转化条件：30℃，250rpm，1vvm通气量反应，反应20h。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，称取异亮氨酸100g、α
‑
酮戊二酸110g、Vc12g、七水合硫酸亚铁0.8g，加自来水溶解，倒入5L发酵罐中，调节料液pH至7.0，加入离心后菌体用量180g，自来水补足至3L，加入泡敌0.5ml，转化条件：30℃，250rpm，1vvm通气量反应，反应24h。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(4)中，向洗脱液中添加15％的活性炭，于60℃脱色30min，抽滤、浓缩，干燥得到产品。
[0019][有益效果][0020]本专利技术以全细胞作为催化剂，以异亮氨酸为底物，底物转化率可以达到98％，结合超滤和离子交换手段，产品中4
‑
HIL的纯度可以达到98％。
[0021]本专利技术利用电导率来准确判断洗脱液的收集终点。
[0022]本专利技术在从离子交换柱上洗脱目的物时，利用氢氧化钠溶液作为洗脱剂，不产生含氨氮的废水。
具体实施方式
[0023]下面结合具体实施例和对比例，对本专利技术进行进一步的阐述。
[0024]4‑
HIL的检测方法：HPLC；柱子：C18，波长254nm，流速0.8ml/min，流动相是甲醇：水：磷酸＝0.55:0.45:0.001，进样量10μl。
[0025]实施例1重组大肠杆菌细胞的培养方法
[0026]试管种子培养基：蛋白胨(Oxoid)10g/L、酵母膏(Oxoid)5g/L、氯化钠10g/L，自来水溶解，定容后分装试管(4mL/管)，121℃灭菌20min。使用前加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素。
[0027]摇瓶种子培养基：蛋白胨(Oxoid)10g/L、酵母膏(Oxoid)10g/L、NaCl 10g/L，自来水溶解，用NaOH调节pH至7.0。分装500mL摇瓶，每瓶100mL，121℃灭菌20min。使用前加入50μg/mL的卡那霉素。
[0028]发酵罐初始培养基：甘油5g/L、蛋白胨(Oxoid)5g/L、酵母膏(Oxoid)5g/L、Na2HPO4·
12 H2O 5g/L、Na2SO
4 0.7g/L、KH2PO
4 3.4g/L、MgSO
4 0.25g/L、NH4Cl 2.7g/L，按3L发酵液进行称量。称取的培养基加入到5L发酵罐中，加入2.8L自来水搅拌至完全溶解，加入0.5mL消泡剂，加入氢氧化钠将pH调节为7.2～7.3，121℃灭菌20min。
[0029]a、利用灭菌牙签挑取重组大肠杆菌单菌落，接种到装有4mL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用全细胞催化法制备4
‑
HIL的方法，其特征在于，所述全细胞是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主、以pET28a为载体表达异亮氨酸双加氧酶，以异亮氨酸为底物构建全细胞催化体系进行转化反应，将转化液进行超滤、离子交换后，再经脱色、浓缩、干燥得到4
‑
HIL产品；包括以下步骤：(1)对重组大肠杆菌进行发酵培养，收集得到菌体；(2)将菌体细胞、底物、缓冲液混合，于28
‑
32℃条件下，转化20
‑
24h，得到转化液；转化体系中，菌体细胞的浓度是120
‑
180g/L，异亮氨酸的浓度是80
‑
100g/L、α
‑
酮戊二酸的浓度是80
‑
120g/L、Vc的浓度是8
‑
12g/L、七水合硫酸亚铁0.3
‑
1.0g/L；(3)将转化液利用超滤膜进行超滤处理以除去蛋白与菌体，得到超滤膜清液；(4)对清液进行离子交换处理，采用的离子交换柱是732阳离子交换树脂，并用1
‑
2％的氢氧化钠溶液进行洗脱；洗脱液的折光≥0.1时开始收集，收集电导率≤1000us/cm的洗脱液；(6)向洗脱液中添加12
‑
15％的活性炭，于55
‑
60℃脱色30min
‑
60min，抽滤、浓缩，干燥得到4
‑
HIL产品。2.根据权利要求1所述的一种利用全细胞催化法制备4
‑
HIL的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓双，宁健飞，蔡立明，
申请(专利权)人：无锡晶海氨基酸股份有限公司，
类型：发明
国别省市：