一种发酵生产L-丝氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵生产L

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产L
‑
丝氨酸的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种发酵生产L
‑
丝氨酸的方法。

技术介绍

[0002]L
‑
丝氨酸是一种能够参与细胞内众多重要活性物质代谢的非必需氨基酸。另外，作为一种重要的工业产物，L
‑
丝氨酸在食品、精细化工及医药方面都有着广泛的应用。目前，L
‑
丝氨酸的合成主要依赖于直接提取以及化学合成，虽然产率较高，但是这两种方法均会对环境造成一定的危害。随着代谢工程和合成生物学的发展，利用微生物反应器，通过系统调控微生物代谢途径使其大量积累某种代谢产物逐渐得到了广泛的应用。大肠杆菌作为一种模式生物，具有生长速度快、培养方法简单等优点，因而常常作为宿主菌用于微生物发酵。但是作为一种代谢中间产物，L
‑
丝氨酸在野生型大肠杆菌中的积累量较低。
[0003]为提高L
‑
丝氨酸的产量，已有研究对野生型大肠杆菌进行基因工程改造，但改造后的大肠杆菌在发酵过程中易出现生长抑制的现象，影响其发酵生产效果。因此，现有的发酵生产L
‑
丝氨酸的方法仍有待进一步的改进。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种发酵生产L
‑
丝氨酸的方法。采用本专利技术的方法可以实现L
‑
丝氨酸的工业化生产，并显著提高了L
‑
丝氨酸的产量。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种发酵生产L
‑
丝氨酸的方法，包括以下步骤：
[0007](1)将L
‑
丝氨酸生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为28
‑
32℃，pH为6.8
‑
7.2，溶氧(DO)为20
‑
40％，搅拌转速150
‑
250rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD
600
值为0.40
‑
0.60时，降温至27
‑
29℃，向体系中加入IPTG进行诱导培养，诱导培养48
‑
52h；
[0008]培养过程中监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的葡萄糖浓度保持在0.5
‑
1.0g/L；所述补料中含有葡萄糖60
‑
80g/L、糖蜜40
‑
60ml/L、叶酸0.3
‑
0.5g/L；
[0009](2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，分离收集上清，即生产得到含有L
‑
丝氨酸的培养液。
[0010]优选的，步骤(1)中，所述L
‑
丝氨酸生产菌由如下方法构建而成：
[0011]将大肠杆菌中的gpmA、sdaA、mtfA、pta、glyA、sdaC、serA、sstT、tdcC、aceA和cycA基因敲除，获得大肠杆菌工程菌；
[0012]将serB基因用sphⅠ和AaaI酶切处理，将serC基因用NcoⅠ和BglⅡ酶切处理，将酶切处理后的serB基因和serC基因整合到质粒PQE
‑
N上，获得第一重组表达载体(pQE
‑
serB&C)；
[0013]将pGEX
‑
kan质粒用ecoNⅠ和ZraⅠ双酶切，再将serAΔ197基因整合到双酶切处理后的质粒pGEX
‑
kan上，获得第二重组表达载体(pGEX
‑
serA)；
[0014]将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入到大肠杆菌工程菌中，即构建得到L
‑
丝氨酸生产菌。
[0015]更优选的，serB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；serC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；质粒PQE
‑
N的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；第一重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；pGEX
‑
kan质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；serAΔ197基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；第二重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0016]优选的，步骤(1)中，L
‑
丝氨酸生产菌的种子液的接入量为发酵培养基重量的10
‑
15％。
[0017]优选的，步骤(1)中，所述发酵培养基的组成为：糖蜜40ml/L、葡萄糖30g/L、玉米浆干粉30g/L、磷酸二氢钾2g/L、柠檬酸0.5g/L、(NH4)2SO
4 5g/L、MgSO4·
7H2O 0.5g/L、MnSO
4 0.08g/L、FeSO
4 0.06g/L、维生素B
1 0.025g/L、生物素(VH)3mg/L、卡那霉素50ppm。
[0018]优选的，步骤(1)中，加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.5mmol/L。
[0019]优选的，步骤(1)中，所述补料中含有葡萄糖70g/L、糖蜜50ml/L、叶酸0.4g/L。
[0020]本专利技术的有益效果：
[0021](1)为提高发酵生产L
‑
丝氨酸的产量，本专利技术首先构建了能够高产L
‑
丝氨酸的生产菌，通过对影响L
‑
丝氨酸表达的各个因素进行综合分析，将解除合成途径中关键酶的反馈抑制、敲除分解途径和过表达合成途径等多个技术手段的组合使用，使得更多的碳源流向L
‑
丝氨酸，从而显著提高了L
‑
丝氨酸的产量。
[0022](2)由于在构建高产L
‑
丝氨酸的生产菌的过程中，将大肠杆菌的多个基因进行了敲除，为避免大肠杆菌在发酵过程中菌体生长受到抑制，本专利技术还对L
‑
丝氨酸的发酵培养基、发酵培养条件等进行了优化。本专利技术的发酵培养基和补料中添加了甜菜糖蜜作为碳源，能够为菌体生长提供粗蛋白、有机碱、矿物质等营养物质，还能降低成本。在补料中添加了叶酸，能够保证蛋氨酸等氨基酸的正常代谢
[0023]经发酵培养，待菌体量增至目标量时，本专利技术将培养温度降至27
‑
29℃，以减少其他无关代谢，进一步提高了目的产物的表达。
[0024]综上，本专利技术通过生产菌的构建和发酵工艺的优化，实现了L
‑
丝氨酸工业化生产，并显著提高了L
‑
丝氨酸的产量。
附图说明
[0025]图1：PQE
‑
60质粒及其改造结构示意图；其中，A为PQE
‑
60质粒的结构示意图；B为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产L
‑
丝氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将L
‑
丝氨酸生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为28
‑
32℃，pH为6.8
‑
7.2，溶氧为20
‑
40％，搅拌转速150
‑
250rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD
600
值为0.40
‑
0.60时，降温至27
‑
29℃，向体系中加入IPTG进行诱导培养，诱导培养48
‑
52h；培养过程中监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的葡萄糖浓度保持在0.5
‑
1.0g/L；所述补料中含有葡萄糖60
‑
80g/L、糖蜜40
‑
60ml/L、叶酸0.3
‑
0.5g/L；(2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，分离收集上清，即生产得到含有L
‑
丝氨酸的培养液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述L
‑
丝氨酸生产菌由如下方法构建而成：将大肠杆菌中的gpmA、sdaA、mtfA、pta、glyA、sdaC、serA、sstT、tdcC、aceA和cycA基因敲除，获得大肠杆菌工程菌；将serB基因用sphⅠ和AaaI酶切处理，将serC基因用NcoⅠ和BglⅡ酶切处理，将酶切处理后的serB基因和serC基因整合到质粒PQE
‑
N上，获得第一重组表达载体；将pGEX
‑
kan质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳明瑞，曹华杰，谢沛，郭永胜，
申请(专利权)人：新泰市佳禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：