微生物酶法生产L-鸟氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种微生物酶法生产L

【技术实现步骤摘要】
微生物酶法生产L
‑
鸟氨酸的方法


[0001]本专利技术涉及氨基酸生产
，具体涉及一种微生物酶法生产L
‑
鸟氨酸的方法。

技术介绍

[0002]L
‑
鸟氨酸(L
‑
ornithine)是碱性氨基酸的一种，但并不参与蛋白质的合成，而是以游离态存在。在生物体内，L
‑
鸟氨酸主要参与尿素循环，对于氨态氮的排出有重要作用。近年来，L
‑
鸟氨酸产品的开发逐渐升温，在医药、保健领域及化学工业的应用也日益广泛，前景一致看好。
[0003]现有制备L
‑
鸟氨酸的方法主要有提取法、化学法、微生物发酵法和酶法。其中，提取法制备L
‑
鸟氨酸的成本太高，且提供工艺繁琐，现已很少报道；化学法合成鸟氨酸，原料来源广泛且成本低，但该法经过多步化学反应合成，收率偏低，且合成出的鸟氨酸为DL型混合物，产物的手性拆分亦给该工艺增加了难度和成本；微生物发酵法制备L
‑
鸟氨酸是近年来主要采用的制备工艺之一，用发酵法生产鸟氨酸原料成本低廉，但产量不高；酶法生产鸟氨酸是利用动植物或微生物体内的精氨酸酶作催化剂，水解精氨酸生成鸟氨酸和尿酸。
[0004]微生物酶法生产L
‑
鸟氨酸专一性强，反应条件温和，同时底物转化率高，产品较纯，有利于后续分离，但是，微生物酶法生产L
‑
鸟氨酸所面临的主要问题有：精氨酸酶的来源受限，目前工业化生产精氨酸酶的报道相对较少；精氨酸酶的活性也有待提高；另外，产物鸟氨酸对精氨酸酶有着很强的反馈抑制作用，导致现有转化体系中底物精氨酸的浓度一般都不高。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种微生物酶法生产L
‑
鸟氨酸的方法。本专利技术通过对精氨酸酶进行定点突变改造处理，提高了精氨酸酶的催化活性；通过构建生产菌株和优化发酵工艺，实现了对突变改造后的精氨酸酶的工业化生产；通过优化底物溶液的组成，解决了产物鸟氨酸对精氨酸酶反馈抑制的问题，提高了底物中精氨酸的浓度。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种微生物酶法生产L
‑
鸟氨酸的方法，包括以下步骤：
[0008]向含有L
‑
精氨酸的底物溶液中加入经定点突变改造的人重组精氨酸酶I，在25
‑
45℃、pH7.2
‑
7.3的条件下搅拌反应4
‑
6h，将精氨酸转化生成L
‑
鸟氨酸；
[0009]所述底物溶液中含有L
‑
精氨酸80
‑
120g/L，磷酸吡哆醛1
‑
3mg/L，二甲基亚砜(DMSO)0.1
‑
0.2mg/L；
[0010]所述经定点突变改造的人重组精氨酸酶I的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0011]优选的，所述底物溶液中含有L
‑
精氨酸100g/L，磷酸吡哆醛2mg/L，二甲基亚砜(DMSO)0.1mg/L。
[0012]优选的，在37℃、pH7.25的条件下搅拌反应4
‑
6h。
[0013]优选的，所述经定点突变改造的人重组精氨酸酶I由如下方法制备得到：
[0014](1)将人重组精氨酸酶I生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32
‑
34℃，pH为6.8
‑
7.2，溶氧(DO)为20
‑
40％，搅拌转速180
‑
220rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD
600
值为0.50
‑
0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L，诱导培养20
‑
28h；
[0015]培养过程中监测体系的甘油含量，当体系的甘油含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的甘油含量保持在0.5
‑
1g/L；
[0016](2)将步骤(1)诱导培养后的培养液的pH值调至7.1
‑
7.3，过均质机破碎；将细胞破碎后的混合匀浆过陶瓷膜，收集滤液；将滤液稀释至滤液中人重组精氨酸酶I的浓度为8
‑
12g/L，采用镍柱亲和层析，将稀释后的滤液进行挂柱，然后加入牛凝血酶溶液进行切割，用生理盐水洗脱，收集洗脱液；将洗脱液过苯甲脒
‑
琼脂糖凝胶树脂，除去牛凝血酶；将过完苯甲脒
‑
琼脂糖凝胶树脂的洗脱液再过Sephadex G
‑
150葡聚糖凝胶，收集3h
‑
8h流出的液体。将收集的液体通过电渗析进行脱盐，收集淡水，浓缩、干燥，即生产得到人重组精氨酸酶I。
[0017]更优选的，步骤(1)中，所述人重组精氨酸酶I生产菌由如下方法构建而成：
[0018]将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将SEQ ID NO.1所示的Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304
‑
Pg3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；再用SphⅠ和SacⅠ对质粒pHT304
‑
Pg3进行双酶切处理，将SEQ ID NO.7所示的arg1基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304
‑
Pg3上，获得重组表达载体(pHT304
‑
Pg3
‑
arg1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到人重组精氨酸酶I生产菌。
[0019]更优选的，步骤(1)中，发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/L、甘油10g/L、酵母膏8g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、三水磷酸氢二钾4g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、柠檬酸2.1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氨苄青霉素100ppm。
[0020]更优选的，步骤(1)中，所述补料中含有甘油400g/L、蛋白胨30g/L、酵母膏100g/L。
[0021]本专利技术的有益效果：
[0022](1)本专利技术首先采用分子动力学模拟的方法对人重组精氨酸酶I进行了结构优化，将人重组精氨酸酶I的第158位的天冬氨酸突变为谷氨酸。突变后的人重组精氨酸酶I的酶活与野生型人重组精氨酸酶I相比，有了显著的提高。针对突变处理后的人重组精氨酸酶I，本专利技术进一步构建了相应的生产菌株，选择pHT304质粒作为基础质粒，并对其进行了改造，将Pg3启动子整合到pHT304质粒，Pg3启动子只有在加入IPTG后才开始表达，因此，将启动子进行替换后，菌株前期生长快，进入稳定期所需时间短，进而提高了人重组精氨酸酶I的表达本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微生物酶法生产L
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鸟氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：向含有L
‑
精氨酸的底物溶液中加入经定点突变改造的人重组精氨酸酶I，在25
‑
45℃、pH7.2
‑
7.3的条件下搅拌反应4
‑
6h，将精氨酸转化生成L
‑
鸟氨酸；所述底物溶液中含有L
‑
精氨酸80
‑
120g/L，磷酸吡哆醛1
‑
3mg/L，二甲基亚砜0.1
‑
0.2mg/L；所述经定点突变改造的人重组精氨酸酶I的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物溶液中含有L
‑
精氨酸100g/L，磷酸吡哆醛2mg/L，二甲基亚砜0.1mg/L。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在37℃、pH7.25的条件下搅拌反应4
‑
6h。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经定点突变改造的人重组精氨酸酶I由如下方法制备得到：(1)将人重组精氨酸酶I生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32
‑
34℃，pH为6.8
‑
7.2，溶氧为20
‑
40％，搅拌转速180
‑
220rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD
600
值为0.50
‑
0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L，诱导培养20
‑
28h；培养过程中监测体系的甘油含量，当体系的甘油含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的甘油含量保持在0.5
‑
1g/L；(2)将步...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹华杰，岳明瑞，谢沛，郭永胜，
申请(专利权)人：新泰市佳禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：