一种发酵生产L-鸟氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵生产L

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产L
‑
鸟氨酸的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种发酵生产L
‑
鸟氨酸的方法。

技术介绍

[0002]L
‑
鸟氨酸(L
‑
ornithine)在生物体内的细胞中普遍存在，其生物活性在新陈代谢的过程中具有很大的作用。L
‑
鸟氨酸作为产生尿素的中间产物，参与了瓜氨酸、精氨酸等氨基酸的新陈代谢，尤其是在鸟氨酸循环中起到重要作用，能够在很大程度上促进体内氨的排出以起到解毒作用，所以对于人体的肝脏细胞来说，L
‑
鸟氨酸是非常重要的。在医学上，L
‑
鸟氨酸也具有广泛的应用，在氨基酸保健品家族中具有重要的地位和广阔的市场前景，直接参与了抗菌性药物的生物或化学合成。
[0003]L
‑
鸟氨酸的制备方法主要有：化学合成法、水解精氨酸法和微生物发酵法。其中：化学合成法制备L
‑
鸟氨酸多采用工业原料为起始反应物，此方法在L
‑
鸟氨酸制备的早期研究中应用较多，但化学法合成L
‑
鸟氨酸的收率低，外消旋严重，分离困难。水解精氨酸法是以精氨酸为原料，在催化剂的作用下经过水解作用生成L
‑
鸟氨酸和尿素，根据催化剂的不同，可分为碱水解精氨酸法和酶水解精氨酸法，水解精氨酸法制备L
‑
鸟氨酸副产物较少，容易分离，但此法以精氨酸为原料，其经济效益要受制于精氨酸和L
‑/>鸟氨酸之间的市场差价。采用微生物发酵法制备L
‑
鸟氨酸为近年来主要采用的制备工艺之一，它大大拓宽了L
‑
鸟氨酸来源，推动了L
‑
鸟氨酸的研究和应用。
[0004]目前对于微生物发酵法制备L
‑
鸟氨酸的研究主要集中在生产菌株的构建和发酵工艺的改造上。通过改进菌种和工艺，L
‑
鸟氨酸的发酵产量有了很大的提高。但是，微生物发酵法制备L
‑
鸟氨酸仍存在菌种控制不稳定、补料发酵和连续发酵控制不易、难以实现工业化生产等问题。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种发酵生产L
‑
鸟氨酸的方法。采用本专利技术的方法可以实现L
‑
鸟氨酸的工业化生产，并显著提高了L
‑
鸟氨酸的产量。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种发酵生产L
‑
鸟氨酸的方法，包括以下步骤：
[0008](1)将L
‑
鸟氨酸生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为28
‑
32℃，pH为6.8
‑
7.2，溶氧(DO)为20
‑
40％，搅拌转速150
‑
250rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD
600
值为0.50
‑
0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG进行诱导培养，使IPTG在体系中的终浓度为0.5mmol/L，22℃保持1h，然后升温至28
‑
32℃继续进行诱导培养，诱导培养整个过程为45
‑
50h；
[0009]培养过程中监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤2.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的葡萄糖浓度保持在0.5
‑
2g/L；
[0010](2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，分离收集上清，即生产得到含有L
‑
鸟氨
酸的培养液。
[0011]优选的，步骤(1)中，所述L
‑
鸟氨酸生产菌由如下方法构建而成：
[0012]将大肠杆菌中的ptsG、poxB、pta、iclR、sucA、sucB、argI、aceA和aceB基因敲除，获得大肠杆菌工程菌；
[0013]将pQE
‑
N质粒用AccⅢ和sphⅠ双酶切，再将argA基因整合到双酶切处理后的质粒pQE
‑
N上，获得重组表达载体(pQE
‑
argA)；
[0014]将获得的重组表达载体导入到大肠杆菌工程菌中，即构建得到L
‑
鸟氨酸生产菌。
[0015]更优选的，质粒pQE
‑
N的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；argA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；重组表达载体(pQE
‑
argA)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0016]优选的，步骤(1)中，L
‑
鸟氨酸生产菌的种子液的接入量为发酵培养基重量的10
‑
15％。
[0017]优选的，步骤(1)中，所述发酵培养基的组成为：甜菜糖蜜40ml/L、葡萄糖30g/L、玉米浆干粉30g/L、磷酸二氢钾2g/L、柠檬酸0.5g/L、(NH4)2SO
4 5g/L、MgSO4·
7H2O 0.5g/L、MnSO
4 0.08g/L、FeSO
4 0.06g/L、维生素B1 0.025g/L、生物素(VH)3mg/L、氨苄青霉素50ppm。
[0018]优选的，步骤(1)中，所述补料中含有葡萄糖70g/L、甜菜糖蜜10ml/L。
[0019]本专利技术的有益效果：
[0020]为提高发酵生产L
‑
鸟氨酸的产量，实现工业化生产，本专利技术从菌株构建和发酵工艺优化两个方面进行了研究。具体来说：
[0021]本专利技术首先构建了能够高产L
‑
鸟氨酸的生产菌，通过对L
‑
鸟氨酸代谢途径进行综合分析，使用基因敲除方法对EMP途径、三羧酸循环、尿素循环等代谢途径进行了改造，使得更多的碳源流向L
‑
鸟氨酸，从而显著提高了L
‑
鸟氨酸的产量；通过对pQE
‑
60质粒进行了改造，敲除了冗杂序列，增加了目的基因的表达量。敲除质粒中原本有的6
‑
His序列，减小了N
‑
乙酰谷氨酸合酶酶活性的丧失。同时通过代谢通路流量计算进行选择，质粒采用低拷贝质粒，启动子选择T5，在保证菌体正常代谢的情况下尽可能多的积累鸟氨酸；通过对argA基因进行过表达，能够解除或降低该酶对鸟氨酸合成速度的影响，提高了整条代谢途径的总速度。
[0022]培养基是提供菌种繁殖和合成各种代谢产物所需要的，培养基的组成对发酵的成败有着至关重要的影响。L
‑
鸟氨酸发酵的碳源一般为葡萄糖，本专利技术对发酵培养基的组成进行了优化，增加了甜菜糖蜜作为碳源，能够为菌体生长提供粗蛋白、有机碱、矿物质等营养物质，还能降低成本。
[0023]合适本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产L
‑
鸟氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将L
‑
鸟氨酸生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为28
‑
32℃，pH为6.8
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7.2，溶氧为20
‑
40％，搅拌转速150
‑
250rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD
600
值为0.50
‑
0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG进行诱导培养，使IPTG在体系中的终浓度为0.5mmol/L，22℃保持1h，然后升温至28
‑
32℃继续进行诱导培养，诱导培养整个过程为45
‑
50h；培养过程中监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤2.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的葡萄糖浓度保持在0.5
‑
2g/L；(2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，分离收集上清，即生产得到含有L
‑
鸟氨酸的培养液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述L
‑
鸟氨酸生产菌由如下方法构建而成：将大肠杆菌中的ptsG、poxB、pta、iclR、sucA、sucB、argI、aceA和ac...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹华杰，谢沛，岳明瑞，郭永胜，
申请(专利权)人：新泰市佳禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：