聚磷酸盐激酶1突变体及其生产菌的构建与应用制造技术

本发明专利技术公开了聚磷酸盐激酶1突变体及其生产菌的构建与应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术对大肠杆菌聚磷酸盐激酶1进行了突变改造处理，将野生型聚磷酸盐激酶1第246位的L突变为P，第247位的M突变为V，获得了聚磷酸盐激酶1突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。与野生型聚磷酸盐激酶1相比，本发明专利技术的聚磷酸盐激酶1突变体的酶活、pH适应性和亲水性都有了显著提高。针对聚磷酸盐激酶1突变体，本发明专利技术还构建了聚磷酸盐激酶1突变体的生产菌。本发明专利技术的生产菌能够特异性外源表达高活性的聚磷酸盐激酶1突变体，极大丰富了聚磷酸盐激酶1突变体的来源。的来源。的来源。

【技术实现步骤摘要】
聚磷酸盐激酶1突变体及其生产菌的构建与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种聚磷酸盐激酶1突变体及其生产菌的构建与应用。

技术介绍

[0002]聚磷酸盐激酶1(polyphosphate kinase 1，PPK1)由聚磷酸盐激酶基因1编码，是大肠杆菌内负责催化ATP脱磷酸残基形成聚磷酸盐的一种主要激酶。PPK1具有广泛的应用：PPK1利用ATP末端的磷酸基合成长链磷酸基聚合；也可以利用多聚磷酸盐(poly P)末端磷酸基使ADP生成ATP。PPK1还是生产腺嘌呤核苷酸(AMP)、鸟嘌呤核苷酸(GMP)、胞嘧啶核苷酸(CMP)、尿嘧啶核苷酸(UMP)、胸腺嘧啶核苷酸(TMP)等产品都会用到的一种酶。
[0003]PPK1在应用中存在的主要问题有：PPK1的酶活一般在650U/mg左右，仍有待进一步的提高；并且PPK1对pH控制较为严格，在生产5＇
‑
单磷酸核苷酸(特别是腺苷单磷酸)时，PPK1和腺苷激酶的最适pH不同但需要混合投料，这进一步影响了PPK1在实际应用中酶活的发挥。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种聚磷酸盐激酶1突变体及其生产菌的构建与应用。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]本专利技术的第一方面，提供一种聚磷酸盐激酶1突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。具体如下：
[0007]MGQEKLYIEKELSWLSFNERVLQEAADKSNPLIERMRFLGIYSNNLDEFYKVRFAELKRRIIISEEQGSNSHSRHLLGKIQSRVLKADQEFDGLYNELLLEMARNQIFLINERQLSVNQQNWLRHYFKQYLRQHITPILINPDTDLVQFLKDDYTYLAVEIIRGDTIRYALLEIPSDKVPRFVNLPPEAPRRRKPMILLDNILRYCLDDIFKGFFDYDALNAYSMKMTRDAEYDLVHEMEASLMEPVSSSLKQRLTAEPVRFVYQRDMPNALVEVLREKLTISRYDSIVPGGRYHNFKDFINFPNVGKANLVNKPLPRLRHIWFDKAQFRNGFDAIRERDVLLYYPYHTFEHVLELLRQASFDPSVLAIKINIYRVAKDSRIIDSMIHAAHNGKKVTVVVELQARFDEEANIHWAKRLTEAGVHVIFSAPGLKIHAKLFLISRKENGEVVRYAHIGTGNFNEKTARLYTDYSLLTADARITNEVRRVFNFIENPYRPVTFDYLMVSPQNSRRLLYEMVDREIANAQQGLPSGITLKLNNLVDKGLVDRLYAASSSGVPVNLLVRGMCSLIPNLEGISDNIRAISIVDRYLEHDRVYIFENGGDKKVYLSSADWMTRNIDYRIEVATPLLDPRLKQRVLDIIDILFSDTVKARYIDKELSNRYVPRGNRRK VRAQLAIYDY IKSLEQPE。
[0008]本专利技术通过gromacs对野生型聚磷酸盐激酶1(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)进行拓扑并分析，定义立方体并填充水分子，得到溶剂化体系，构建盒子，然后在盒子中添加抗衡离子，再在charmm力场下进行能量最小化，然后进行NVT平衡和NPT平衡，再对成品进行1ns的MD模拟，最终将野生型聚磷酸盐激酶1第246位的L突变为P，第247位的M突变为V，得到聚磷酸盐激酶1突变体。
[0009]本专利技术的聚磷酸盐激酶1突变体，其酶活性达800
‑
850U/mg，与野生型聚磷酸盐激酶1相比，其酶活性有了显著的提高；而且，本专利技术的聚磷酸盐激酶1突变体所适应的pH范围广，在pH5.0
‑
pH9.3之间均能保持较高的酶活性，更适合工业化生产。
[0010]本专利技术的第二方面，提供编码上述聚磷酸盐激酶1突变体的基因。
[0011]优选的，编码上述聚磷酸盐激酶1突变体的基因经密码子优化处理，优化后编码聚磷酸盐激酶1突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0012]本专利技术的第三方面，提供一种聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的构建方法，包括以下步骤：
[0013](1)将pQE
‑
60质粒用BspEⅠ和AflⅢ双酶切，再连接上序列如SEQ ID NO.5所示的片段，构建得到质粒pQE
‑
N；用AccⅢ和SphⅠ对质粒pQE
‑
N双酶切，再将编码聚磷酸盐激酶1突变体的基因连接到酶切后的质粒上，获得重组表达载体pQE
‑
ppk1；
[0014](2)将获得的重组表达载体pQE
‑
ppk1导入到大肠杆菌中，构建得到聚磷酸盐激酶1突变体生产菌。
[0015]优选的，步骤(1)中，质粒pQE
‑
N的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0016]由于pQE
‑
60质粒太大，而太大的质粒既不利于自身复制，也会在表达较小的外源基因时难以进行重组体的筛选。因此，本申请对pQE
‑
60质粒进行了改造，切掉了对发酵生产而言无用的元件，同时还引入了新的酶切位点，以便于连入编码聚磷酸盐激酶1突变体的基因。
[0017]优选的，步骤(1)中，重组表达载体pQE
‑
ppk1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0018]优选的，步骤(2)中，所述大肠杆菌为E.coli K
‑
12。
[0019]本专利技术的第四方面，提供上述方法构建得到的聚磷酸盐激酶1突变体生产菌。
[0020]本专利技术的第五方面，提供上述聚磷酸盐激酶1突变体生产菌在发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体中的应用。
[0021]本专利技术的有益效果：
[0022](1)本专利技术首先对大肠杆菌聚磷酸盐激酶1进行了突变改造处理，将野生型聚磷酸盐激酶1第246位的L突变为P，第247位的M突变为V，获得了聚磷酸盐激酶1突变体。本专利技术的聚磷酸盐激酶1突变体具有如下突出的优势：
[0023]①
本专利技术的聚磷酸盐激酶1突变体的酶活性达800
‑
850U/mg，与野生型聚磷酸盐激酶1相比，酶活提高了23％
‑
33％。
[0024]②
本专利技术的聚磷酸盐激酶1突变体对pH的适应范围广，能够在pH5.0
‑
pH9.3之间均能保持较高的酶活性，更适合工业化生产。
[0025]③
本专利技术的聚磷酸盐激酶1突变体的亲水性增加，酶的溶解度上升，更有利于酶的工业化应用。
[0026](2)针对聚磷酸盐激酶1突变体，本专利技术还构建了聚磷酸盐激酶1突变体的生产菌。本专利技术的生产菌能够特异性外源表达高活性的聚磷酸盐激本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种聚磷酸盐激酶1突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.编码权利要求1所述聚磷酸盐激酶1突变体的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。4.一种聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将pQE
‑
60质粒用BspEⅠ和AflⅢ双酶切，再连接上序列如SEQ ID NO.5所示的片段，构建得到质粒pQE
‑
N；用AccⅢ和SphⅠ对质粒pQE
‑
N双酶切，再将编码聚磷酸盐激酶1突变体的基因连接到酶切后的质粒上，获得重组表达载体pQE
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳明瑞，谢沛，曹华杰，郭永胜，
申请(专利权)人：新泰市佳禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：