一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法，包括以下步骤：(1)将聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD

A method of producing polyphosphate kinase 1 mutant by fermentation

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法。

技术介绍

[0002]多聚磷酸盐(polyphosphate，poly P)作为一种广泛存在的线性多聚体，由几个至数百个磷酸盐残基通过与ATP磷酸酐键相同的的高能磷酸键相互聚合形成。近年来研究发现，poly P不仅是生物体中不可或缺的生物能和磷酸基团储存库、负电荷密度高的生物大分子，还在微生物中参与调节基因表达、调控细菌离子通道和DNA摄取、代谢等，并与哺乳动物中瞬时电位的调节、线粒体代谢、细胞钙化等生理过程有着密切的关系。
[0003]聚磷酸盐激酶1(polyphosphate kinase 1，PPK1)是poly P合成代谢的关键酶。PPK1通过催化ATP末端的磷酸基团转移到磷酸盐上而形成多聚磷酸盐这一可逆反应的发生，从而将磷酸盐聚集形成多聚磷酸盐。此外，PPK1还是生产腺嘌呤核苷酸(AMP)、鸟嘌呤核苷酸(GMP)、胞嘧啶核苷酸(CMP)、尿嘧啶核苷酸(UMP)、胸腺嘧啶核苷酸(TMP)等产品都会用到的一种酶。因此，PPK1具有广阔的应用前景，市场需求较大。
[0004]但是，现有PPK1的酶活一般在650U/mg左右，仍有待进一步的提高；并且PPK1对pH控制较为严格，在生产5＇
‑
单磷酸核苷酸(特别是腺苷单磷酸)时，PPK1和腺苷激酶的最适pH不同但需要混合投料，这进一步影响了PPK1在实际应用中酶活的发挥。此外，目前还很少见有实现工业化发酵生产PPK1的报道。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法。本专利技术通过对聚磷酸盐激酶1进行突变处理得到聚磷酸盐激酶1突变体，提高了聚磷酸盐激酶1的酶活；并构建了聚磷酸盐激酶1突变体的发酵生产体系，实现了聚磷酸盐激酶1突变体的工业化生产。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法，包括以下步骤：
[0008](1)将聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32
‑
34℃，pH为6.8
‑
7.2，溶氧(DO)为20
‑
40％；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD
600
值为0.40
‑
0.60时，降温至21
‑
23℃，向体系中加入IPTG进行诱导培养，诱导培养20
‑
24h；
[0009]培养过程监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的残糖浓度保持在0.5
‑
1.0g/L；
[0010](2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，分离收集上清，即生产得到含有聚磷酸盐激酶1突变体的培养液。
[0011]优选的，步骤(1)中，所述聚磷酸盐激酶1突变体生产菌由如下方法构建而成：
[0012]将pQE
‑
60质粒用BspEⅠ和AflⅢ双酶切，再连接上序列如SEQ ID NO.5所示的片段，构建得到质粒pQE
‑
N，所述质粒pQE
‑
N的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；用AccⅢ和SphⅠ对质粒pQE
‑
N双酶切，再将编码聚磷酸盐激酶1突变体的基因连接到酶切后的质粒上，获得重组表达载体pQE
‑
ppk1，所述重组表达载体pQE
‑
ppk1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
[0013]将获得的重组表达载体pQE
‑
ppk1导入到大肠杆菌中，构建得到聚磷酸盐激酶1突变体生产菌。
[0014]优选的，步骤(1)中，聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的种子液的接入量为发酵培养基重量的4
‑
8％。
[0015]优选的，步骤(1)中，所述发酵培养基的组成为：蛋白胨2.5g/L、脱脂豆粉20g/L、葡萄糖5g/L、甜菜糖蜜5g/L，酵母膏8g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、三水磷酸氢二钾4g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、柠檬酸2.1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氨苄青霉素100ppm。
[0016]优选的，步骤(1)中，加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L。
[0017]优选的，步骤(1)中，所述补料的组成为：葡萄糖200g/L、甜菜糖蜜200g/L、酵母膏80g/L、脱脂豆粉60g/L。
[0018]优选的，步骤(2)中，采用均质机进行破菌处理，均质处理的条件为：均质压力12,000PSI，均质流量200
‑
300L/Hr。
[0019]优选的，步骤(2)中，所述聚磷酸盐激酶1突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0020]本专利技术的有益效果：
[0021](1)本专利技术首先对大肠杆菌聚磷酸盐激酶1进行了突变改造处理，将野生型聚磷酸盐激酶1第246位的L突变为P，第247位的M突变为V，获得了聚磷酸盐激酶1突变体。本专利技术的聚磷酸盐激酶1突变体具有如下突出的优势：
[0022]①
本专利技术的聚磷酸盐激酶1突变体的酶活性达800
‑
850U/mg，与野生型聚磷酸盐激酶1相比，酶活提高了23％
‑
33％。
[0023]②
本专利技术的聚磷酸盐激酶1突变体对pH的适应范围广，能够在pH5.0
‑
pH9.3之间均能保持较高的酶活性，更适合工业化生产。
[0024]③
本专利技术的聚磷酸盐激酶1突变体的亲水性增加，酶的溶解度上升，更有利于酶的工业化应用。
[0025](2)本专利技术还对聚磷酸盐激酶1突变体的发酵培养基、发酵培养条件以及诱导培养条件进行了优化。其中，本专利技术的发酵培养基选择糖蜜作为碳源之一，具有以下好处：
[0026]①
含有高浓度的腐熟型有机质、腐殖酸、生化类黄腐酸、氨基酸、高吸收率的NPK；
[0027]②
含有在发酵过程中产生的UGF；
[0028]③
降低粉尘及颗粒料的粉化率，减少了损失；
[0029]④
促进菌体生长，改善部分生产性能；
[0030]⑤
降低成本，糖蜜比葡萄糖便宜一半左右。
[0031]加入少量柠檬酸能减少菌种延滞期时间；加入脱脂豆粉、酵母膏都可降低成本。
[0032]综上，本专利技术通过生产菌的构建和发酵工艺的优化，实现了聚磷酸盐激酶1突变体的规模化、工业化生产，并显著提高了聚磷酸盐激酶1的酶活。
附图说明
[0033]图1：通过分子动力学模拟软件分析野生型聚磷酸盐激酶1的亲水性。
[0034]图2：通过分子动力学模拟软本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32
‑
34℃，pH为6.8
‑
7.2，溶氧为20
‑
40％；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD
600
值为0.40
‑
0.60时，降温至21
‑
23℃，向体系中加入IPTG进行诱导培养，诱导培养20
‑
24h；培养过程监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的残糖浓度保持在0.5
‑
1.0g/L；(2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，分离收集上清，即生产得到含有聚磷酸盐激酶1突变体的培养液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述聚磷酸盐激酶1突变体生产菌由如下方法构建而成：将pQE
‑
60质粒用BspEⅠ和AflⅢ双酶切，再连接上序列如SEQ ID NO.5所示的片段，构建得到质粒pQE
‑
N，所述质粒pQE
‑
N的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；用AccⅢ和SphⅠ对质粒pQE
‑
N双酶切，再将SEQ ID NO.4所...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳明瑞，谢沛，曹华杰，郭永胜，
申请(专利权)人：新泰市佳禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：