具有增强的DNA产生的经修饰的细菌逆转录元件制造技术

提供了经修饰以增强多拷贝单链DNA(msDNA)的产生的工程化反转录子。此外，还公开了编码这种工程化反转录子的载体系统以及在多种应用例如CRISPR/Cas介导的基因组编辑、重组工程、细胞条码化和分子记录中使用工程化反转录子和编码其的载体系统的方法。转录子和编码其的载体系统的方法。转录子和编码其的载体系统的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有增强的DNA产生的经修饰的细菌逆转录元件
[0001]优先权申请
[0002]本申请要求2019年9月12日提交的美国临时申请系列No.62/899,625的申请日的优先权权益，其内容通过引用其整体具体并入本文中。
[0003]通过引用作为文本文件提供的序列表并入
[0004]序列表作为文本文件“2072305.txt”提供，其创建于2020年9月10日，以及其大小为12,288字节。该文本文件的内容通过引用其整体并入本文中。

技术介绍

[0005]反转录子是逆转录元件，其存在于在几乎所有黏细菌中(Dhundale et al.Journal of Bacteriology 164,914
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917(1985))，在大肠杆菌(E.coli)(Lampson et al.Science 243,1033
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1038(1989)),V.cholerae(Inouye et al.Microbiology and Immunology 55,510
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513)和其他细菌中很少见。反转录子操纵子按顺序编码RNA引物(多拷贝单链RNA，msr)、待逆转录的RNA序列(多拷贝单链DNA，msd)和逆转录酶。反转录子转录物通过自身进行折叠并部分逆转录以生成约80个碱基的单链DNA(single stranded DNA，ssDNA)。虽然反转录子来源的DNA是单链的，但其包含双链DNA的发夹。多个反转录子ssDNA也可以相互互补以形成更大的双链元件。反转录子变体具有不同的DNA长度和碱基含量，但广泛共享这种整体形式。
[0006]由反转录子生成的ssDNA已在两种背景下用于基因组工程：细菌背景，具有用于重组工程的λRed Beta重组酶(Farzadfard et al.Science 346,1256272,(2014))；和真核生物背景，作为酵母中用于Cas9编辑的同源定向修复(homology
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directed repair，HDR)模板(Sharon et al.Cell 175,544
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557.e516,(2018))。尽管前景广阔，但这些应用经受低于预期的效率和背景限制，其可能源于反转录子内源形式中的元件。这些包括(1)具有将ssDNA的5'端与msr RNA的2'羟基连接的磷酸二酯键的分支结构，(2)不变侧翼区，其可能是反转录子逆转录所需的，但不是修复模板的一部分，(3)有限的总长度，和(4)作为用于Pol III转录的终止子发挥作用的天然poly T延伸。

技术实现思路

[0007]提供了经修饰以增强多拷贝单链DNA(multicopy single
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stranded DNA，msDNA)的产生的工程化反转录子，其解决与效率和低拷贝数相关的许多现有问题。本文中还描述了编码这种工程化反转录子的载体系统以及在多种应用例如CRISPR/Cas介导的基因组编辑、重组工程、细胞的条码化和分子记录中使用工程化反转录子和载体系统的方法。
[0008]在一个方面中，提供了工程化反转录子，该工程化反转录子包含：a)msr前序列；b)编码多拷贝单链RNA(msRNA)的msr基因；c)编码多拷贝单链DNA(msDNA)的msd基因；d)包含与msr前序列具有序列互补性的自身互补区的msd后序列，其中自身互补区的长度比野生型互补区长至少1至50个核苷酸，使得该工程化反转录子能够增强msDNA的产生；以及e)编码逆转录酶的ret基因。
[0009]自身互补区由ncRNA的3'和5'端之间的氢键形成。在某些实施方案中，互补区的长度比野生型互补区长至少1、至少2、至少4、至少6、至少8、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少30、至少40或至少50个核苷酸。例如，自身互补区可具有比野生型互补区长1至50个核苷酸的长度，其包括该范围内的任何长度，例如长1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在某些实施方案中，自身互补区的长度比野生型互补区长1至16个核苷酸。
[0010]在某些实施方案中，msr基因和msd基因以反式排列或顺式排列提供。在一些实施方案中，ret基因相对于msr基因和/或msd基因以反式排列提供。
[0011]在某些实施方案中，msr基因、msd基因和ret基因源自细菌反转录子，其包括但不限于黏细菌反转录子(例如，Mx65、Mx162)、大肠杆菌(Escherichia coli)反转录子(例如，E67、Ec73、EC83、EC86、EC107)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)反转录子(例如msDNA
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St85)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)反转录子(例如Vc81、Vc95、Vc137)。
[0012]在某些实施方案中，工程化反转录子还包含目的异源序列。异源序列可以插入到例如msr基因或msd基因中。例如，异源序列可以插入到msd茎环的环中。在一些实施方案中，异源序列编码多肽或肽。在另一些实施方案中，异源序列编码供体多核苷酸，该供体多核苷酸包含与5'基因组靶序列杂交的5'同源臂和与3'基因组靶序列杂交的3'同源臂，所述5'同源臂和所述3'同源臂位于包含通过同源定向修复(homology directed repair，HDR)或重组工程待被整合至基因组靶基因座处的目的编辑物的核苷酸序列的侧翼。在另一些实施方案中，异源序列包含CRISPR前间隔区DNA序列。在一个实施方案中，CRISPR前间隔区DNA序列包含经修饰的“AAG”前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)。
[0013]在某些实施方案中，工程化反转录子还包含条码序列。条码序列可位于例如msDNA的发夹环中。
[0014]在另一个方面中，提供了载体系统，该载体系统包含含有本文中所述的工程化反转录子的一个或更多个载体。在某些实施方案中，msr基因和msd基因由相同的载体或不同的载体提供。在一些实施方案中，msr基因、msd基因和ret基因由同一载体提供，其中该载体包含与msr基因和msd基因可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，启动子还与ret基因可操作地连接。在另一些实施方案中，载体还包含与ret基因可操作地连接的第二启动子。在某些实施方案中，msr基因、msd基因和ret基因由不同的载体提供。
[0015]在某些实施方案中，载体系统的一种或更多种载体是病毒载体或非病毒载体(例如，质粒)。
[0016]在某些实施方案中，载体系统包含工程化反转录子，其包含编码供体多核苷酸的异源序列，所述供体多核苷酸包含在供体多核苷酸序列侧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.工程化反转录子，其包含：a)msr前序列；b)编码多拷贝单链RNA(msRNA)的msr基因；c)编码多拷贝单链DNA(msRNA)的msd基因；d)msd后序列，其包含与所述msr前序列具有序列互补性的自身互补区，其中所述自身互补区的长度比野生型互补区长1至50个核苷酸，使得所述工程化反转录子能够增强所述msDNA的产生；以及e)编码逆转录酶的ret基因。2.权利要求1所述的工程化反转录子，其还包含目的异源序列。3.权利要求2所述的工程化反转录子，其中所述异源序列被插入至所述msr基因或所述msd基因中。4.权利要求1所述的工程化反转录子，其中由所述msd基因编码的单链DNA(msDNA)包含msd茎环，并且其中所述环包含目的异源序列。5.权利要求2所述的工程化反转录子，其中所述异源序列编码供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包含与5'靶序列杂交的5'同源臂和与3'靶序列杂交的3'同源臂，所述5'同源臂和所述3'同源臂位于包含待通过同源定向修复(HDR)或重组工程整合至靶基因座处的目的编辑物的核苷酸序列的侧翼。6.权利要求2所述的工程化反转录子，其中所述异源序列包含CRISPR前间隔区DNA序列。7.权利要求6所述的工程化反转录子，其中所述CRISPR前间隔区DNA序列包含经修饰的AAG前间区序列邻近基序(PAM)。8.权利要求1所述的工程化反转录子，其还包含条码序列。9.权利要求8所述的工程化反转录子，其中所述条码序列位于所述msDNA的发夹环中。10.权利要求4所述的工程化反转录子，其中所述msd茎的长度为至少14个核苷酸(碱基对)。11.权利要求4所述的工程化反转录子，其中所述msd茎可以包含一个或更多个错配的核苷酸。12.权利要求4所述的工程化反转录子，其中所述msd茎具有少于五个或六个连续错配的核苷酸。13.权利要求4所述的工程化反转录子，其中所述msd茎在所述msd茎基部侧翼的序列中没有任何错配或插入。14.权利要求4所述的工程化反转录子，其中相对于所述野生型msd序列的任何msd茎错配或序列改变都在所述msd茎的中部。15.权利要求1所述的工程化反转录子，其中所述msr基因和所述msd基因以反式排列或顺式排列提供。16.权利要求1所述的工程化反转录子，其中所述ret基因相对于所述msr基因和所述msd基因以反式排列提供。17.权利要求1所述的工程化反转录子，其中所述msr基因、msd基因和ret基因是经修饰的细菌反转录子msr基因、msd基因和ret基因。
18.权利要求1所述的工程化反转录子，其中所述msr基因、msd基因和ret基因独立地为经修饰的黏细菌反转录子、经修饰的大肠杆菌(Escherichia coli)反转录子、经修饰的肠沙门氏菌(Salmonella enterica)反转录子或经修饰的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)反转录子。19.权利要求18所述的工程化反转录子，其中所述经修饰的大肠杆菌反转录子是经修饰的EC83或经修饰的EC86。20.载体系统，其包含含有权利要求1所述的工程化反转录子的一种或更多种载体。21.权利要求20所述的载体系统，其中所述msr基因和所述msd基因通过同一载体或不同的载体提供。22.权利要求20所述的载体系统，其中所述msr基因、所述msd基因和所述ret基因由同一载体提供。23.权利要求22所述的载体系统，其中所述同一载体包含与所述msr基因和所述msd基因可操作地连接的启动子。24.权利要求23所述的载体系统，其中所述启动子还与所述ret基因可操作地连接。25.权利要求23所述的载体系统，其还包含与所述ret基因可操作地连接的第二启动子。26.权利要求20所述的载体系统，其中所述msr基因、所述msd基因和所述ret基因由不同的载体提供。27.权利要求20所述的载体系统，其中所述一种或更多种载体是病毒载体或非病毒载体。28.权利要求27所述的载体系统，其中所述非病毒载体是质粒。29.权利要求20所述的载体系统，其中所述工程化反转录子包含供体多核苷酸，所述供体多核苷酸包含与5'靶序列杂交的5'同源臂和与3'靶序列杂交的3'同源臂，所述5'同源臂和所述3'同源臂位于包含待通过同源定向修复(HDR)或重组工程整合在靶基因座处的目的编辑物的核苷酸序列的侧翼。30.权利要求29所述的载体系统，其还包含编码RNA指导的核酸酶的载体。31.权利要求30所述的载体系统，其中所述RNA指导的核酸酶是Cas核酸酶或工程化的RNA指导的FokI
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核酸酶。32.权利要求31所述的载体系统，其中所述Cas核酸酶是Cas9或Cpf1。33.权利要求20所述的载体系统，其中所述工程化反转录子包含CRISPR前间隔区DNA序列。34.权利要求33所述的载体系统，其还包含编码Cas1和/或Cas2蛋白的载体。35.权利要求34所述的载体系统，其还包含含有CRISPR阵列序列的载体。36.权利要求20所述的载体系统，其还包含编码噬菌体同源重组蛋白的载体。37.权利要求36所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：塞特，
申请(专利权)人：哈佛大学，
类型：发明
国别省市：