本发明专利技术提供一种增强型逆转录酶，其特征为：在野生型逆转录酶mmlv的基础上，具有L22V；D145Q；C240G；T288E；L319A；L385K；T431Q；H595I；Q563A九个氨基酸位点的突变，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。并公开了其编码DNA、试剂盒以及其在RNA文库构建中的应用。本发明专利技术的含有增强型逆转录酶的快速RNA建库试剂盒相比常规RNA建库试剂盒省去了第二链cDNA合成步骤，缩短了建库时间，显著的降低了文库扩增的循环数，缩短了建库时间，3.5h可以完成500pg级别的RNA建库。别的RNA建库。别的RNA建库。
【技术实现步骤摘要】
增强型逆转录酶、编码DNA、试剂盒及其在RNA文库构建中的应用
[0001]本专利技术专利涉及一种增强型逆转录酶、编码DNA、试剂盒及其在RNA文库构建中的应用，属于生物
技术介绍
[0002]二代测序已经广泛地应用于生物学研究的各个领域。NGS具有通量高，成本较低，灵敏度NGS，可以一次检测几百万甚至上亿的遗传信息，加快了全基因组测序的速度，从而显著的降低了测序的费用。NGS给人类及动植物基因组学、转录组学、宏基因组等带来了巨大的便利。尤其是近几年在病原检测领域，二代测序表现出更为明显的优势。常规的病原检测，需要进行病原培养，受培养基等因素的影响，会有阳性率低，检测周期长等问题。二代测序可以不依赖于培养直接从样本中获得病原的遗传信息，对未知的病原可以快速的组装遗传信息，对新发病原体感染鉴定发挥了重要的作用。
[0003]病原样本具有核酸提取量少，核酸污染等问题。尤其是RNA类病原提取，会带有宿主gDNA残留等风险，会严重的影响RNA类病原的检出率。此外，RNA类病原的核酸较少，容易存在建库失败等风险。因此亟需一款高效的RNA逆转录酶，可以对微量的RNA样本完成高效的逆转录，完成测序文库的构建，便于医生做出快速准确地诊断。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的是提供一种增强型逆转录酶，能提高RNA的逆转录能力，保证RNA文库构建的成功率。
[0005]本专利技术采用的技术方案为：一种增强型逆转录酶，其特征为：在野生型逆转录酶mmlv的基础上，具有L22V；D145Q；C240G；T288E；L319A；L385K；T431Q；H595I；Q563A九个氨基酸位点的突变，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0006]本专利技术还公开了上述的增强型逆转录酶的编码DNA，其特征为：其序列如SEQ ID NO：2所示。
[0007]本专利技术还公开了上述的增强型逆转录酶在RNA文库构建中的应用。
[0008]本专利技术还公开了一种快速RNA建库试剂盒，包含上述的增强型逆转录酶。
[0009]优选的，快速RNA建库试剂盒还包括如下试剂组分：1st cDNA合成酶反应缓冲液和随机引物；片段化酶和反应缓冲液；连接酶和反应缓冲液文库扩增试剂。
[0010]优选的，增强型逆转录酶使用量是100~300U，更优选的是200U；。
[0011]优选的，还包含Murine RNase Inhibitor，优选的使用量是20~60U，更优选的是40U。
[0012]优选的，所述1st cDNA合成酶反应缓冲液包括：100~200 mM pH 8.3的Tris
‑
HcL、10~20 mM MgcL2、200~300 mM KcL、20~40 mM DTT 、1~2 mM dNTPs，优选地缓冲液是：150 mM Tris
‑
HcL（pH 8.3）、15 mM MgcL2、250 mM KcL、30 mM DTT，1.5 mM dNTPs。
[0013]优选的，随机引物是4~10个核苷酸的寡核苷酸片段，优选地是6~8个核苷酸的寡核苷酸片段。
[0014]本专利技术的快速RNA建库试剂盒中，片段化酶和反应缓冲液、连接酶和反应缓冲液、文库扩增试剂均可以采用翌圣生物的Hieff NGS
®ꢀ
DNA&RNA Library Co
‑
Prep Kit for Illumina
®
（Cat.12299）建库试剂盒的酶切建库试剂盒组分。本专利技术的快速RNA建库试剂盒，不需要进行第二链cDNA的合成步骤，可以直接对逆转录完成的cDNA进行全长cDNA的片段化。相比常规RNA建库试剂盒省去了第二链cDNA合成步骤，缩短了建库时间，显著的降低了文库扩增的循环数，缩短了建库时间，3.5h可以完成500pg级别的RNA建库。
[0015]本专利技术的有益效果为：本专利技术的增强型逆转录对RNA具有高效的逆转录能力，可以明显的降低RNA建库的起始量下线，保证RNA样本的建库成功率。
[0016]本专利技术的增强型逆转录酶具有更强的逆转录能力，相对于野生型酶，文库扩增循环数可以降低2~4个，对低于检测限的样本，也能建库成功。
附图说明
[0017]图1本专利技术的快速RNA建库流程及常规RNA建库的流程分析。
[0018]图2本专利技术的快速RNA建库流程及常规RNA建库的建库文库质检分析。
[0019]图3本专利技术的快速RNA建库流程及常规RNA建库的不同投入量RNA建库文库质检分析。
具体实施方式
[0020]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做进一步说明，此处表述的具体实施例因适用于解释本专利技术。
[0021]实施例1：突变的增强型逆转录酶的获得对于病原领域，存在样本浓度较低，建库成功率较差的问题。我们在本专利技术中对全长cDNA合成模块的逆转录酶进行定点突变。对于鼠白血病病毒的逆转录酶mmlv野生型进行了九个位点的定点突变：L22V；D145Q；C240G；T288E；L319A；L385K；T431Q；H595I；Q563A。委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成了上述逆转录酶突变体的编码DNA，其序列如SEQ ID NO：2。将突变增强型逆转录酶的编码基因SEQ ID NO：2序列进行蛋白表达，得到增强型逆转录酶。
[0022]实施例2：增强型逆转录酶在RNA建库中的应用本实施案例是利用293 细胞系总RNA进行如下所示的建库流程分析。本专利技术使用的常规RNA建库流程是参照翌圣生物的Hieff NGS
®ꢀ
DNA&RNA Library Co
‑
Prep Kit for Illumina
®
（Cat.12299）建库试剂盒说明书进行总RNA的建库。利用实施例1记载的增强型逆转录酶的快速RNA建库流程参照图1，进行建库测试：1）取10ng 总RNA进行RNA变性处理：表1：RNA变性体系及变性条件
2）利用增强型逆转录酶进行1st cDNA的合成：表2：1st cDNA的反应体系及反应条件3）利用DNA聚合酶进行2nd cDNA的合成：表3：2nd cDNA的反应体系及反应条件4）利用12299建库试剂盒的酶切体系进行Full Length
‑
cDNA的片段化：表4：Full Length
‑
cDNA的片段化反应体系及反应条件5）利用12299建库试剂盒的接头连接体系进行片段化cDNA的接头连接反应：表5：片段化cDNA的接头连接反应体系及反应条件
6）参照12299建库试剂盒的连接后纯化体系，进行0.6
×
的磁珠纯化连接产物，最后使用22μL的ddH2O进行洗脱，最后取20μL进行文库的扩增反应。
[0023]7）利用12299建库试剂盒的扩增体系进行文库的扩增反应：表6：文库扩增反应体系及反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种增强型逆转录酶，其特征为：在野生型逆转录酶mmlv的基础上，具有L22V；D145Q；C240G；T288E；L319A；L385K；T431Q；H595I；Q563A九个氨基酸位点的突变，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.权利要求1所述的增强型逆转录酶的编码DNA，其特征为：其序列如SEQ ID NO：2所示。3.权利要求1所述的增强型逆转录酶在RNA文库构建中的应用。4.一种快速RNA建库试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的增强型逆转录酶。5.根据权利要求4所述的快速RNA建库试剂盒，其特征在于试剂组分还包括：1st cDNA合成酶反应缓冲液和随机引物；片段化酶和反应缓冲液；连接酶和反应缓冲液文库扩增试...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋东亮，刘娜，曹振，戴广伟，柴常升，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。