【技术实现步骤摘要】
本专利技术专利涉及一种防污染的多重tngs病原建库试剂及多重tngs病原扩增方法，属于生物。
技术介绍
1、防污染的试剂需要用dutp来替换dna的碱基组成dttp,同时试剂中需含有udgase来消化第一轮含dutp的扩增产物的泄露，从而达到防污染的效果。因此t碱基含量高的基因的扩增在防污染的体系中的扩增要差于正常含dttp的试剂。多重tngs建库试剂是最新推出的高达3000重以上的扩增试剂，为达到较好的临床检测的效果，要求试剂对不同的靶标扩增具有较好的均一性，这不仅要求在多重引物设计时需要考虑引物间的相互影响，同时要求试剂扩增不具有基因偏好性。综合防污染的试剂对不同结构基因的扩增具有偏好性和多重tngs建库试剂的要求试剂均一性的矛盾点，常规的设计无法满足一款无偏好性扩增的防污染多重tngs病原建库试剂的要求。
2、本专利技术通过试剂的巧妙设计和扩增程序设计，创造出一款均一性好的防污染多重tngs病原建库试剂。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种高生物活性wnt3a融合蛋白的简便的生产工艺。
2、本专利技术采用的技术方案为：一种防污染的多重tngs病原建库试剂，包括一轮防污染多重扩增试剂a和二轮防污染多重扩增试剂b；
3、其中一轮防污染多重扩增试剂a包括50-100mm甜菜碱和1％-10％吡咯烷酮、0.1-1uugdase、20mm-40mm tris-hcl、50-80mm kcl、3-4mm mgcl2、5-10u taq019kh
4、二轮防污染多重扩增试剂b包括20mm-40mm tris-hcl、50-80mm kcl、3-4mmmgcl2、5-10utaq019khs、0.05-0.1mm datp、0.05-0.1mm dgtp、0.05-0.1mm dctp、0.05-0.2mm dutp。
5、本专利技术还公开了一种防污染的多重tngs病原扩增方法，其步骤包括：
6、(1)以检测样本为模板，在前述的一轮防污染多重扩增试剂a和多重引物的作用下进行第一轮pcr扩增；
7、(2)以第一轮pcr扩增产物为模板，添加p5接头和p7引物,在前述的二轮防污染多重扩增试剂b的作用下进行接头连接和第二轮pcr扩增。
8、多重引物采用现有的多重tngs的引物即可，比如yeasen 13592的多重引物，接头和引物可以采用yeasen 12412试剂盒中的接头和引物，第二轮扩增完成后即可直接上机测序。
9、优选的，步骤(1)中在第一轮扩增前，反应体系先在ugdase反应温度下放置5min，以消化环境中的含u产物。
10、优选的，步骤(1)中，每25ul反应体系中包括一轮防污染多重扩增试剂a 6.26ul，多重扩增primer mix 2-3ul，模板10ng，余量为h20。
11、优选的，步骤(1)中的第一轮扩增反应程序为：
12、
13、优选的，步骤(1)和(2)之间还包括步骤(1’):对第一轮扩增的pcr产物进行纯化。
14、优选的，步骤(2)中，每25ul反应体系中包括二轮防污染多重扩增试剂b12.5ul，p50x 1ul，p70x 1ul，第一轮pcr扩增产物10ng，余量为h20。
15、优选的，步骤(2)的第一轮扩增反应程序为：
16、
17、优选的，步骤(2)之后还包括步骤(2’):对第二轮扩增的pcr产物进行纯化。
18、普通的防污染多重tngs建库试剂往往在一轮扩增试剂中同时添加udg和dutp，虽然满足了防污染的效果，但往往会牺牲文库的扩增均一性。本专利技术提供了一种防污染的多重tngs病原建库试剂，一轮扩增试剂含udg,以消化含u的文库的气溶胶污染，二轮扩增试剂含dutp,制备出含u的扩增文库；本专利技术将udg和dutp分开添加，既可以满足防污染的效果，同时试剂的扩增均一性可以达到普通的不含防污染效果的试剂的均一性。
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1.一种防污染的多重tNGS病原建库试剂，其特征在于包括一轮防污染多重扩增试剂A和二轮防污染多重扩增试剂B；
2.一种防污染的多重tNGS病原扩增方法，其特征在于其步骤包括：
3.根据权利要求2所述的多重tNGS病原扩增方法，其特征在于步骤(1)中在第一轮扩增前，反应体系先在UGDase反应温度下放置5-10min。
4.根据权利要求2所述的多重tNGS病原扩增方法，其特征在于步骤(1)中，每25ul反应体系中包括一轮防污染多重扩增试剂A 6.26ul，多重扩增Primer mix 2-3ul，模板10ng，余量为H20。
5.根据权利要求4所述的多重tNGS病原扩增方法，其特征在于步骤(1)中的第一轮扩增反应程序为：
6.根据权利要求2所述的多重tNGS病原扩增方法，其特征在于步骤(1)和(2)之间还包括步骤(1’):对第一轮扩增的PCR产物进行纯化。
7.根据权利要求2所述的多重tNGS病原扩增方法，其特征在于步骤(2)中，每25ul反应体系中包括二轮防污染多重扩增试剂B12.5ul，P50x 1ul，P
8.根据权利要求7所述的多重tNGS病原扩增方法，其特征在于步骤(2)的第一轮扩增反应程序为：
9.根据权利要求2所述的多重tNGS病原扩增方法，其特征在于步骤(2)之后还包括步骤(2’):对第二轮扩增的PCR产物进行纯化。
...【技术特征摘要】
1.一种防污染的多重tngs病原建库试剂，其特征在于包括一轮防污染多重扩增试剂a和二轮防污染多重扩增试剂b；
2.一种防污染的多重tngs病原扩增方法，其特征在于其步骤包括：
3.根据权利要求2所述的多重tngs病原扩增方法，其特征在于步骤(1)中在第一轮扩增前，反应体系先在ugdase反应温度下放置5-10min。
4.根据权利要求2所述的多重tngs病原扩增方法，其特征在于步骤(1)中，每25ul反应体系中包括一轮防污染多重扩增试剂a 6.26ul，多重扩增primer mix 2-3ul，模板10ng，余量为h20。
5.根据权利要求4所述的多重tngs病原扩增方法，其特征在于步骤(1)中的...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓亮，马海玲，曹振，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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