用于转座酶定向进化的辅助P-质粒、转座酶定向进化的系统及Tn5转座酶突变体技术方案

本发明专利技术公开了一种用于转座酶定向进化的辅助P

【技术实现步骤摘要】
用于转座酶定向进化的辅助P
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质粒、转座酶定向进化的系统及Tn5转座酶突变体


[0001]本专利技术专利涉及一种用于转座酶定向进化的辅助P
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质粒、转座酶定向进化的系统及Tn5转座酶突变体，属于生物


技术介绍

[0002]转座酶在自然界中广泛存在，被认为是基因组重排和进化的重要驱动力之一。Tn5转座酶是一种常见的转座酶，是一步酶法建库技术中的核心蛋白，通过体外装配形成Tn5蛋白与接头序列的多元复合物，依赖转座酶的“剪切与粘贴”活性，在打断基因组DNA的同时将特异性接头加装至每一个DNA片段的两端。接头序列通常由三部分组成，包括用于DNA片段PCR扩增及测序的引物结合序列、用于样本溯源的Barcode标签、以及被Tn5转座酶特异性识别的长为19bp的ME序列(AGATGTGTATAAGAGACAG)。受二代测序单次读长的限制，打断的基因组片段长度在300bp左右最佳。但由于酶活性、装配体系等因素的影响，基因组不能被彻底打断，大量过长片段的存在严重损伤了酶法建库的质量。同时，由于野生型Tn5转座酶蛋白本身存在一定的偏好性，建库的均一性和覆盖度不能满足需求。
[0003]另一方面，随着CUT&Tag技术的兴起和广泛应用，人们对Tn5转座酶的“剪切与粘贴”活性提出了更高的要求。在CUT&Tag技术中，利用抗体与靶蛋白(抗原)的特异性识别与结合，以及非特异性抗体结合蛋白与抗体恒定区的结合，引导Tn5转座酶定向切割与靶蛋白存在相互作用的DNA序列并加装接头以实现定向建库。随后通过测序即可鉴定靶蛋白在基因组上的结合位点。与传统的Chip
‑
Seq等技术相比，CUT&Tag的DNA投入量更低、实验周期更短，加上抗原抗体的特异性亲和及接头PCR的特异性扩增，测序的信噪比更高，可更好地用于表观遗传学、大分子间的相互作用等领域的研究。
[0004]因此，开发一种高效的酶活性筛选方法，以获得一些酶活性更高的转座酶，就显得尤为重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种用于转座酶定向进化的辅助P
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质粒，可以辅助快速筛选出酶活性更高的转座酶。
[0006]本专利技术采用的技术方案为：一种用于转座酶定向进化的辅助P
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质粒，所述辅助P
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质粒包含受诱导表达的PIII neg基因，用于表达拮抗蛋白PIII neg；以及转座酶特异性识别序列，并实现转座酶活性与噬菌体拮抗蛋白PIII neg表达水平的关联。
[0007]优选的，在受诱导表达的PIII neg基因启动子的侧翼加入所述转座酶特异性识别序列。
[0008]优选的，所述转座酶为Tn5转座酶，所述转座酶特异性识别序列的序列为AGATGTGTATAAGAGACAG。
[0009]优选的，所述转座酶特异性识别序列成对存在，分列所述受诱导表达的PIII neg
selection and stringency modulation in phage
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assisted continuous evolution.Nat Chem Biol.2014 Mar；10(3):216
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22.)，通过在PIII neg基因启动子侧翼加入转座酶特异性识别序列，将转座酶的活性与子代噬菌体的生长相关联。当细胞内表达高活性的转座酶突变体时，PIII neg蛋白由于启动子缺失而表达量降低，PIII蛋白在细胞内的丰度将超过PIII neg，进而实现子代噬菌体的正常繁殖。在筛选过一定代次后，可通过降低脱水四环素浓度及提高IPTG浓度来增加筛选压力。此时PIII的表达下调，PIII neg的表达上调，子代噬菌体需要更高活性的转座酶才能确保子代噬菌体的繁殖，从而筛选出活性更高的转座酶。本专利技术还借助易错PCR的方法构建了表达不同转座酶突变体的噬菌体文库，以实现对氨基酸突变频率的控制，并大幅缩短传代周期。利用上述定向进化的方法，获得一个新的Tn5转座酶的突变体，与野生型Tn5转座酶相比，其核酸酶活性显著提高。
附图说明
[0029]图1：Tn5转座酶进化原理示意图；
[0030]图1中P+代表可诱导表达噬菌体衣壳蛋白PIII的质粒，其中PIII由脱水四环素诱导表达；Phage代表改造后的噬菌体基因组，Tn5 DNA序列取代了pIII基因序列，受gIII启动子控制；P
‑
代表可表达拮抗蛋白PIII neg的质粒，后者表达盒上游存在两串Tn5识别序列ME以及lac启动子，受IPTG诱导表达。C
PIII
及C
Neg
分别代表细胞内PIII和PIII neg蛋白的浓度，仅当PIII浓度大于PIII neg(即C
PIII
>C
Neg
)时，噬菌体可在细胞内正常繁殖。
[0031]图2：转座酶表达测试；
[0032]图2中0、0.5、1.0分别代表诱导Tn5表达的IPTG诱导浓度0、0.5mM、1.0mM。
[0033]图3：转座酶胞内活性测试；
[0034]图3中ΔRFI代表相比于未诱导时荧光强度差异的绝对值；横坐标代表不同终浓度的L
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阿拉伯糖；T50为表达亲本转座酶(SEQ.NO.1)的大肠杆菌，T51为表达富集后的转座酶(SEQ.NO.2)的大肠杆菌。
[0035]图4：T51转座酶的亲和纯化；
[0036]图4中S代表超声离心后上清，P代表超声离心后沉淀；1
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12代表0
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100％梯度洗脱收集的洗脱液。
[0037]图5：T50转座酶的亲和纯化；
[0038]图5中S代表超声离心后上清，P代表超声离心后沉淀；1
‑
12代表0
‑
100％梯度洗脱收集的洗脱液。
[0039]图6：转座酶体外活性测试；
[0040]图6中0～5.0代表转座酶的投入量分别为0～5.0μL。
具体实施方式
[0041]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做进一步说明，但实施例的描述不对本专利技术的保护范围产生任何限制。
[0042]除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。
[0043]下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。
[0044]实施例1：
[0045]1、按图1所示构建辅助质粒(P+质粒及P
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质粒)(质粒模板可采用Miller SM et al.Phage
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assisted continuous and non
‑
conti本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于转座酶定向进化的辅助P
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质粒，其特征在于所述辅助P
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质粒包含受诱导表达的PIII neg基因，用于表达噬菌体拮抗蛋白PIII neg；以及转座酶特异性识别序列，并实现转座酶活性与噬菌体拮抗蛋白PIII neg表达水平的关联。2.根据权利要求1所述的辅助P
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质粒，其特征在于在受诱导表达的PIII neg基因启动子的侧翼加入所述转座酶特异性识别序列。3.根据权利要求2所述的辅助P
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质粒，其特征在于所述转座酶为Tn5转座酶，所述转座酶特异性识别序列的序列为AGATGTGTATAAGAGACAG。4.根据权利要求3所述的辅助P
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质粒，其特征在于所述转座酶特异性识别序列成对存在，分列所述受诱导表达的PIII neg基因启动子两侧。5.根据权利要求2所述的辅助P
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质粒，其特征在于所述受诱导表达的PIII neg基因启动子包含转录因子结合区及阻遏蛋白结合区，转录因子结合区为P
lac
、P
tet
、P
BAD
或P
trp
，阻遏蛋白结合区为LacI蛋白结合序列、TetR蛋白结合序列或AraC蛋白结合序列。6.一种转座酶定向进化的系统，其特征在于包括：辅助P+质粒、携带转座酶的噬菌体重组基因组、宿主细胞，还包括权利要求1
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5中任一项所述的辅助P
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质粒；所述辅助P+质粒包含受诱导表达的gIII基因，用于表达噬菌体衣壳蛋白的PIII蛋白；所述携带转座酶的噬菌体重组基因组中噬菌体的所述gIII基因被所述转座酶的编码序列取代，且所述转...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘想，唐琼卫，谢薇，商曰朋，刘峰，秦雪梅，曹振，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：