一种环状长单链DNA制备方法技术

本发明专利技术公开了一种环状长单链DNA制备方法，涉及核酸技术领域。本发明专利技术制备pMC.cirDNA载体，载体上包括attB元件、attP元件以及诱导型启动子；并在attB元件后添加Nt.BspQI识别位点，attP元件前添加Nb.BsrDI识别位点；将目的DNA克隆至pMC.cirDNA载体BspQI识别位点与BsrDI识别位点之间；诱导、转化、纯化得到环状长单链DNA。本发明专利技术利用此方法可在30日内制备100

【技术实现步骤摘要】
一种环状长单链DNA制备方法


[0001]本专利技术涉及核酸
，具体涉及一种环状长单链DNA制备方法。

技术介绍

[0002]环状DNA具有线性DNA不具备的动力学和拓补学特点，因此环状单链DNA在分子生物和DNA纳米技术、生物医药等领域有着广发的应用前景。目前常用基于CircLigase或T4 DNA ligase及辅助DNA制备环状单链DNA的方法得率低、易产生多聚体副产物，随着底物DNA链长度的增大，催化成环的效率急剧降低，如何高效率地制备环状长单链DNA及如何进行大批量环状DNA的制备是环状DNA制备面临的两大难题。
[0003]切刻酶是一种能特异性的识别双链DNA的特定序列并对其中的一条链进行切割，产生缺口的限制性内切酶；SBI公司开发的Minicircle DNA制备试剂盒中，菌株ZYCY10P3S2T E.coli，在阿拉伯糖调控启动子的调控下表达phiC31整合酶和IsceI限制性内切酶，phiC31重组酶系统特异性介导attP位点attB位点之间的重组，生成包含attL的骨架DNA和包含attR的目的基因DNA，IsceI作用于包含attL的骨架DNA部分(含有8个IsceI识别位点)，将其线性化，随后被大肠杆菌体内的核酸酶降解，保留包含attR的目的基因DNA，最后从细菌体内提取纯化。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种环状长单链DNA制备方法，解决以下技术问题：
[0005]现有的技术中基于CircLigase或T4 DNA ligase及辅助DNA制备环状单链DNA的方法得率低、易产生多聚体副产物，随着底物DNA链长度的增大，催化成环的效率急剧降低。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0007]一种环状长单链DNA制备方法，包括如下步骤：
[0008]S1：构建pMC.cirDNA载体，pMC.cirDNA载体上包括attB元件、attP元件以及诱导型启动子；
[0009]S2：在attB元件后添加Nt.BspQI识别位点，attP元件前添加Nb.BsrDI识别位点；
[0010]S3：将目的DNA克隆至pMC.cirDNA载体BspQI识别位点与BsrDI识别位点之间；
[0011]S4：测序验证正确后转化至宿主细胞中过夜培养；
[0012]S5：通过用与诱导型启动子对应的诱导剂诱导表达后提取粗品MinicircleDNA；
[0013]S6：粗品Minicircle DNA纯化得到高纯度Minicircle DNA；
[0014]S7：Nt.BspQI或Nb.BsrDI酶切高纯度Minicircle DNA，使微环DNA产生缺口；并利用ExoⅠ核酸外切酶消化线性化单链DNA，纯化后获取得到环状长单链DNA。
[0015]作为本专利技术的进一步方案：所述宿主细胞为ZYCY10P3S2T E.coli细胞。
[0016]作为本专利技术的进一步方案：所述Nt.BspQI识别位点的核苷酸序列为gaagagc。
[0017]作为本专利技术的进一步方案：所述Nb.BsrDI识别位点的核苷酸序列为gcaatg。
[0018]作为本专利技术的进一步方案：所述诱导型启动子为阿拉伯糖启动子，所述诱导剂为
阿拉伯糖。
[0019]作为本专利技术的进一步方案：S6中纯化具体步骤为：用骨架特异性限制内切酶及核酸外切酶除未亲本质粒及基因组DNA获得高纯度Minicircle DNA。
[0020]作为本专利技术的进一步方案：pMC.cirDNA载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体如下：
[0021][0022][0023][0024]本专利技术的有益效果：
[0025]本申请改造了一种minicircle DNA制备pMC.cirDNA载体，并在pMC.cirDNA载体上设置Nt.BspQI识别位点、Nb.BsrDI识别位点，目的DNA克隆至pMC.cirDNA载体BspQI识别位点与BsrDI识别位点之间；其在宿主细胞中在诱导剂诱导转化后，目的基因以及切刻酶诱导表达，并用骨架特异性限制内切酶及核酸外切酶除未亲本质粒及基因组DNA获得高纯度Minicircle DNA。Nt.BspQI或Nb.BsrDI酶切高纯度Minicircle DNA，使微环DNA产生缺口；并利用ExoⅠ核酸外切酶消化线性化单链DNA，纯化后获取得到环状长单链DNA。本专利技术建立了由pMC.cirDNA、切刻酶获取环状ssDNA的流程，利用此方法可在30日内制备100
‑
8000nt，2ug
‑
10mg的环状ssDNA。
附图说明
[0026]下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。
[0027]图1是本专利技术pMC.cirDNA载体图谱。
具体实施方式
[0028]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0029]请参阅图1，一种环状长单链DNA制备方法，包括如下步骤：
[0030]S1：构建pMC.cirDNA载体，pMC.cirDNA载体上包括attB元件、attP元件以及阿拉伯糖启动子；其attP元件核心的39bp序列为ccccaactggggtaacctTTGagttctctcagttggggg，attB元件核心的34bp序列为gtgccagggcgtgcccTTGggctccccgggcgcg；
[0031]S2：在attB元件后添加Nt.BspQI识别位点，attP元件前添加Nb.BsrDI识别位点；Nt.BspQI识别位点的核苷酸序列为gaagagc；Nb.BsrDI识别位点的核苷酸序列为gcaatg；
[0032]S3：将目的DNA克隆至pMC.cirDNA载体BspQI识别位点与BsrDI识别位点之间；
[0033]S4：测序验证正确后转化至ZYCY10P3S2T E.coli细胞中，30
°
过夜培养；
[0034]S5：通过用与阿拉伯糖启动子对应的阿拉伯糖诱导表达后提取粗品Minicircle DNA；
[0035]S6：用骨架特异性限制内切酶及核酸外切酶除未亲本质粒及基因组DNA获得高纯度Minicircle DNA；
[0036]S7：Nt.BspQI或Nb.BsrDI酶切高纯度Minicircle DNA，使微环DNA产生缺口；并利用ExoⅠ核酸外切酶消化线性化单链DNA，纯化后获取得到环状长单链DNA。
[0037]pMC.cirDNA载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体如下：
[0038][0039][0040][0041][0042]以上对本专利技术的一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种环状长单链DNA制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：构建pMC.cirDNA载体，pMC.c irDNA载体上包括attB元件、attP元件以及诱导型启动子；S2：在attB元件后添加Nt.BspQI识别位点，attP元件前添加Nb.BsrDI识别位点；S3：将目的DNA克隆至pMC.cirDNA载体BspQI识别位点与BsrD I识别位点之间；S4：测序验证正确后转化至宿主细胞中过夜培养；S5：通过用与诱导型启动子对应的诱导剂诱导表达后提取粗品Minicircle DNA；S6：粗品Minicircle DNA纯化得到高纯度Minicircle DNA；S7：Nt.BspQI或Nb.BsrDI酶切高纯度Minicircle DNA，使微环DNA产生缺口；并利用ExoⅠ核酸外切酶消化线性化单链DNA，纯化后获取得到环状长单链DNA。2.根据权利要求1所述的一种环状长单...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻明军，崔康乐，王维坤，纪世春，
申请(专利权)人：通用生物安徽股份有限公司，
类型：发明
国别省市：