一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体、重组菌及表达纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体、重组菌及表达纯化方法，属于外源表达技术领域。本发明专利技术公开了表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体，以及表达限制性内切酶SapⅠ的重组菌，利用所述重组菌生产限制性内切酶SapI。本发明专利技术的制备方法能够在较短时间内制备得到高纯度、高活性的SapⅠ限制性内切酶，极大地降低了SapⅠ的制备成本，提高了制备效率。率。率。

【技术实现步骤摘要】
一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体、重组菌及表达纯化方法


[0001]本专利技术属于外源表达
，具体涉及一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体、重组菌及表达纯化方法。

技术介绍

[0002]限制性核酸内切酶是可以识别特定的脱氧核苷酸序列并进行切割的核酸酶，它能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自身的DNA却无损害作用，从而起到保护细胞原有的遗传信息的作用。限制性内切酶的发现促使DNA重组技术的诞生，从而极大地推动了现代分子生物学和基因工程的发展，是当代基因工程研究不可或缺的基础工具。
[0003]在细菌中，限制性内切酶及其相应的甲基转移酶构成限制
‑
修饰系统，即自身的DNA被甲基化酶修饰，从而避免所产生的限制性内切酶对自身DNA片段的切割。限制
‑
修饰基因常紧密连锁，细菌通过调控二者的表达，使自身DNA首先受到甲基化保护，保护完成后再表达限制性内切酶，而入侵的异源DNA并没有受到保护因此被限制性内切酶降解。即胞内相关的甲基转移酶对与其配对的限制性内切酶识别的相同特定序列进行甲基化修饰，并使修饰的DNA具有抵抗其限制性内切酶的切割特性，保护宿主DNA而降解未被甲基化修饰的外源DNA。
[0004]关于限制
‑
修饰系统在原核细胞中表达的研究表明，系统的建立和维持是以甲基转移酶的保护作用为前提。由于DNA分子的结构组成和特性，自然界中主要存在三类DNA甲基转移酶，分别是C5甲基酶、N4胞嘧啶和N6腺嘌呤甲基酶。当一个有限制性内切酶识别位点的DNA被甲基转移酶修饰后，这个DNA分子就会具有抵抗相应限制酶切割的特性。即通常情况下，如果DNA识别序列相同(或识别序列包含在内)并且甲基化酶修饰位点和方式也一致，那么这种经过甲基转移酶特异性甲基化修饰的DNA就具有可以抵抗相似识别序列的限制性内切酶的切割作用，从而保护宿主细胞的DNA免受破坏。
[0005]自20世纪60年代末第一个限制性内切酶被发现之后，越来越多的限制性内切酶被发现、提纯并获得广泛应用。关于限制性内切酶的研究，多年来着重与它们作为工具酶的实用价值，包括新酶的发现与筛选、高产工程菌株的构建、酶纯化技术与程序的优化改进等。其中SapⅠ是一种应用较为广泛的限制性内切酶，其识别位点是：5
’‑
GCTCTTC
‑3’‑3’‑
CGAGAAG
‑5’
，不仅可以作为普通的限制性内切酶应用于分子克隆，在生物制药方向也具有广泛的需求和应用价值。但由于表达量低、分离纯化程序繁琐、蛋白得率低等问题，目前市售的SapⅠ限制酶价格偏高，在一定程度上限制了它的广泛应用。因此，提供一种高表达量、低成本、分离纯化程序简便、蛋白得率高的制备SapⅠ的方法具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组表达载体、重组菌及表达纯化方法，可稳定且高效进行限制酶SapⅠ的重组表达，制备方法操作简单，能够在较短的
原液稀释10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍的双酶切图，最终活力定为600U/μL。
具体实施方式
[0024]本专利技术提供了一种重组表达载体，包括至少一个拷贝的限制性内切酶SapⅠ的编码基因。
[0025]本专利技术所述重组表达载体中优选还包括GFP
‑
Sumo片段，且所述GFP
‑
Sumo片段与限制性内切酶SapⅠ的编码基因一端连接。本专利技术所述限制性内切酶SapⅠ的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.1所示；所述GFP
‑
Sumo片段的核苷酸序列优选如SEQ ID No.2所示。
[0026]本专利技术所述重组表达载体含有位于限制性内切酶SapⅠ编码基因上游的T7启动子、GFP
‑
Sumo序列以及标签序列，所述启动子用于驱动所述编码基因的转录，所述GFP
‑
Sumo序列可以减少SapⅠ基因的突变并增加可溶性表达，所述GFP
‑
Sumo序列与所述编码基因可通过PCR无缝连接。本专利技术所述GFP
‑
Sumo能与SapⅠ更好地配合作用，减少SapⅠ基因的突变的同时进一步提高SapⅠ蛋白的表达水平。本专利技术对所述标签序列的种类并没有特殊限定，如实施例中选择8
×
His标签序列。
[0027]本专利技术对所述重组表达载体的构建方法并没有特殊限定，利用本领域的常规技术手段将所述限制性内切酶SapⅠ的编码基因片段克隆到基础载体中即可，所述基础载体优选为原核表达载体，实施例中以pET
‑
28a为例进行说明，通过同源重组将限制性内切酶SapⅠ的编码基因和GFP
‑
Sumo片段整合到pET
‑
28a中的..。
[0028]本专利技术还提供了一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组菌的构建方法，包括以下步骤：
[0029]分别利用上述重组表达载体和第二重组载体共转化感受态细胞，筛选后得所述重组菌；
[0030]所述第二重组载体包括限制性内切酶SapⅠ的甲基转移酶的编码基因。
[0031]本专利技术利用上述重组表达载体和第二重组载体共转化感受态细胞，所述第二重组载体优选含有一个或多个拷贝的限制性内切酶SapⅠ所对应的特异性甲基转移酶M.SapⅠ的编码基因，由于限制性内切酶SapⅠ的识别序列是不对称的(一条链为5
’‑
GCTCTTC
‑3’
，另一条链为5
’‑
GAAGAGC
‑3’
)，故该天然特异性甲基化酶M.SapⅠ具有两个亚基，分别为M1和M2。因此，所述的特异性甲基转移酶M.SapⅠ是由M1和M2通过柔性融合蛋白接头(GGGGS)3相连而组成的。本专利技术经密码子优化的甲基转移酶M.SapⅠ的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.3所示。本专利技术在构建所述第二重组载体时，优选将上述SEQ ID No.3所示的序列通过同源重组连接入表达载体pUC
‑
19中，得到甲基转移酶重组表达载体pUC
‑
19
‑
M.SapⅠ。
[0032]本专利技术利用上述重组表达载体和第二重组载体(甲基转移酶重组表达载体pUC
‑
19
‑
M.SapⅠ)共同转化感受态细胞，本专利技术所述感受态细胞优选为原核细胞，实施例中选择原核表达系统中的大肠杆菌表达系统，具有周期短、培养条件简单、成本低等特点。本专利技术优选将限制性内切酶SapⅠ重组表达载体和特异性甲基转移酶M.SapⅠ重组表达载体共同转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂布于氨苄卡纳霉素抗性平板进行培养。
[0033]本专利技术还提供了利用上述构建方法构建得到的表达限制性内切酶SapⅠ的重组菌。
[0034]本专利技术还提供了利用上述重组菌生产限制性内切本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组表达载体，其特征在于，包括至少一个拷贝的限制性内切酶SapⅠ的编码基因。2.根据权利要求1所述重组表达载体，其特征在于，还包括GFP
‑
Sumo片段，且所述GFP
‑
Sumo片段与限制性内切酶SapⅠ的编码基因一端连接。3.根据权利要求1或2所述重组表达载体，其特征在于，所述限制性内切酶SapⅠ的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。4.一种表达限制性内切酶SapⅠ的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：分别利用权利要求1～3任一项所述重组表达载体和第二重组载体共转化感受态细胞，筛选后得所述重组菌；所述第二重组载体包括限制性内切酶SapⅠ的甲基转移酶的编码基因。5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，所述第二重组载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛愿超，王若言，李生，赵幸会，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：