MNR-MBP蛋白质的发酵和纯化工艺制造技术

本发明专利技术公开了表达MNR

【技术实现步骤摘要】
MNR
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MBP蛋白质的发酵和纯化工艺


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体而言，本专利技术涉及MNR
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MBP蛋白质的发酵和纯化工艺。

技术介绍

[0002]肿瘤细胞疫苗有可能激活免疫系统，让它们直面癌症细胞。肿瘤疫苗诱导肿瘤特异的免疫反应，激活免疫系统进攻带有特殊抗原的癌细胞。在众多免疫抗原中，粘蛋白MUC1被赋予希望。最初发现MUC1具有保护和润滑上皮的功能。后来陆续发现它在细胞信号传导以及从恶性细胞转化到肿瘤扩散的肿瘤发生的所有阶段均起着重要作用。MUC1是一种高度糖基化的跨膜蛋白，是一种I型跨膜蛋白，具有高度糖基化的胞外结构域，从细胞表面延伸200
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500纳米。全长分为胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区由脯氨酸，苏氨酸和富含丝氨酸的(PTS)域和SEA域组成。PTS域，也叫可变数目串联重复序列(VNTR)区，由高度多态的外显子编码，该外显子编码多个20
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21个氨基酸序列重复序列组成，而MUC1的胞内区(CT)是高度保守的。MUC1的过表达通常与结肠癌，乳腺癌，卵巢癌，肺癌和胰腺癌有关。MUC1被证明存在于各种腺癌中。在一项原发性肝癌的病人治疗研究中，MUC1高表达的病人比例高达68％。同时手术后复发的比例也是最高，跟MUC1表达强度呈正相关。另外，MUC1在一些血液恶性肿瘤的也是过度表达。肿瘤组织和正常组织的MUC1不仅在表达量上有差异，肿瘤与正常组织的MUC1糖基化也存在差异。低糖基化的MUC1是在肿瘤细胞的整个表面过度表达，使肿瘤细胞粘附力的降低，为肿瘤转移提供了便利。已经形成的肿瘤中，大量MUC1可以抑制NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，还可以抑制细胞毒淋巴细胞(CTL)的增殖,甚至可以诱导CTL凋亡。
[0003]疫苗接种可以为宿主提供长期的保护作用，且几乎没有副作用，是治疗癌症的重要方法之一。理论上MUC1应该是一个非常好的疫苗抗原，但在人体临床试验中的临床效果并不理想。疫苗产生的抗体大多不能与肿瘤细胞很好地结合，无法有效保护机体杀灭肿瘤。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，申请人研制的针对人体癌症细胞的注射免疫用MUC1重组蛋白MNR
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MBP，其中MBP是蛋白质表达促溶成分，有助于蛋白质的纯化，也有研究表明MBP可以诱导机体免疫系统的T淋巴细胞活化。在此基础上，本专利技术进一步提供其发酵和纯化工艺，对于提高使用重组融合蛋白的产品稳定性、降低单位剂量成本具有重要意义。
[0005]本专利技术第一方面提供一种表达融合蛋白菌株的构建方法，所述方法包括利用融合蛋白基因连接载体、转化、诱导表达和/或所分离的菌体进行发酵的步骤。
[0006]根据本专利技术，所述融合蛋白包括麦芽糖结合蛋白MBP和粘蛋白MUC1
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N。
[0007]优选地，所述融合蛋白由麦芽糖结合蛋白MBP和粘蛋白MUC1
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N串联而成。
[0008]更进一步地，所述MUC1
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N的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MBP的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。优选地，所述MUC1
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N的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述MBP的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0009]更进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。根据本专利技术，所述载体优选pET载体。所述转化使用的感受态细胞，优选BL21(DE3)。所述诱导表达使用IPTG诱导。优选地，所述菌株包含核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的基因。
[0010]本专利技术第二方面提供一种表达融合蛋白的菌株，所述菌株是通过上述构建方法获得的。更优选，通过测定所述菌株的蛋白表达量进行进一步筛选。
[0011]本专利技术第三方面提供一种融合蛋白的发酵方法，所述方法包括利用融合蛋白发酵、再用所述发酵液和/或所分离的菌体进行发酵的步骤。
[0012]其中，所述融合蛋白包括麦芽糖结合蛋白MBP和粘蛋白MUC1
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N。
[0013]优选地，所述融合蛋白由麦芽糖结合蛋白MBP和粘蛋白MUC1
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N串联而成。
[0014]更优选地，所述MUC1
‑
N的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MBP的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。优选地，所述MUC1
‑
N的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述MBP的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0015]更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0016]根据本专利技术，优选利用本专利技术构建的表达融合蛋白的菌株。优选地，所述菌株包含核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的质粒。所述发酵体系的配方优选5.0g/L酵母提取物、5.0g/L NaCl、3.5g/L KH2PO4、6.6g/L K2HPO4.3H2O、3.5g/L(NH4)2HPO4、1.0g/LMgSO4.7H2O、1mL消泡剂灭菌后加入除菌过滤的0.1g/L VB1、10.0g/L葡萄糖。更优选的，所述发酵体系的配方还含有10.0g/L胰蛋白胨和/或微量元素。
[0017]其中，所述微量元素为CuSO450μmol/L，ZnSO430μmol/L，MnSO450μmol/L，FeSO430μmol/L。
[0018]根据本专利技术，优选本专利技术所述发酵温度37℃。所述发酵培养诱导前培养0
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2h的搅拌转速为400rpm，2
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3h为550rpm，3
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11h为700rpm。空气关联溶氧，起始为1
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2vvm，氧气在2vvm后和溶氧关联。葡萄糖低于2g/L开始补料，3
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5h补料速率为35mL/L/h，5
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7h补料速率为65mL/L/h，7
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11h为35mL/L/h。
[0019]其中，所述补液为：250g/L酵母提取物，250g/L葡萄糖。所述发酵培养OD
600nm
值达到50时开始加入IPTG终浓度为0.5mM，37℃，诱导培养4h。
[0020]本专利技术第四方面提供一种融合蛋白的制备方法，所述方法包括发酵含有能表达所述融合蛋白的表达载体的微生物，其中，所述方法还包括利用分离的发酵液中的融合蛋白、将所分离的菌体进行发酵的步骤。
[0021]根据本专利技术，所述方法还包括利用本专利技术所述的发酵方法对本专利技术表达融合蛋白的菌株进行发酵的步骤。
[0022]本专利技术第五方面提供一种分离和/或纯化融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
[0023](1)发酵本专利技术的表达融合蛋白的菌株；
[0024](2)菌体破碎后澄清。
[0025]优选地，对步骤(2)菌体破碎后通过过滤澄清。优选用微米过滤澄清本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达融合蛋白菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括利用融合蛋白基因连接载体、转化、诱导表达和/或所分离的菌体进行发酵的步骤。所述融合蛋白包括麦芽糖结合蛋白MBP和粘蛋白MUC1
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N。优选地，所述融合蛋白由麦芽糖结合蛋白MBP和粘蛋白MUC1
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N串联而成。更优选地，所述MUC1
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N的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MBP的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。优选地，所述MUC1
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N的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述MBP的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。2.根据权利要求1的构建方法，其特征在于，所述载体优选pET载体。所述转化使用的感受态细胞优选BL21(DE3)。所述诱导表达使用IPTG诱导。优选地，所述菌株包含核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的基因。3.一种表达融合蛋白的菌株，其特征在于，所述菌株是通过权利要求1或2的构建方法获得的。更优选，通过测定所述菌株的蛋白表达量进行进一步筛选。4.一种融合蛋白的发酵方法，其特征在于，所述方法包括利用融合蛋白、发酵、再用所述发酵液和/或所分离的菌体进行发酵的步骤。其中，所述融合蛋白包括麦芽糖结合蛋白MBP和粘蛋白MUC1
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N。优选地，所述融合蛋白由麦芽糖结合蛋白MBP和粘蛋白MUC1
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N串联而成。更优选地，所述MUC1
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N的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MBP的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。优选地，所述MUC1
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N的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述MBP的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。5.根据权利要求4的发酵方法，其特征在于，利用权利要求1或2的构建方法构建的表达融合蛋白的菌株。优选地，所述菌株包含核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的质粒。其中，所述发酵体系的配方优选5.0g/L酵母提取物、5.0g/L NaCl、3.5g/L KH2PO4、6.6g/LK2HPO4.3H2O、3.5g/L(NH4)2HPO4、1.0g/L MgSO4.7H2O、1mL消泡剂灭菌后加入除菌过滤的0.1g/L VB1、10.0g/L葡萄糖。更优选的，所述发酵体系的配方还含有10.0g/L胰蛋白胨和/或微量元素。其中，所述微量元素为CuSO450μmol/L，ZnSO430μmol/L，MnSO450μmol/L，FeSO430μmol/L。优选地，所述发酵温度37℃。所述发酵培养诱导前培养0
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2h的搅拌转速为400rpm，2
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3h为550rpm，3
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11h为700rpm。空气关联溶氧，起始为1
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2vvm，氧气在2vvm后和溶氧关联。葡萄糖低于2g/L开始补料，3
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5h补料速率为35mL/L/h，5
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7h补料速率为65mL/L/h，7
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11h为35mL/L/h。其中，所述补液为：250g/L酵母提取物，250g/L葡萄糖。所述发酵培养OD
600nm...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡炯，刘毅，付玉洁，牟晨，陈钰，祁丽丽，丁国中，肖凯，宋旭，刘明霞，杨雪，王关炼，
申请(专利权)人：元本珠海横琴生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：