一种以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽的筛选方法，属于免疫分析化学技术领域。本发明专利技术以抗OTA的驼源纳米抗体Nb为靶标筛选模拟表位肽，利用噬菌体展示技术从噬菌体环七肽库中筛选针对OTA的表位模拟肽，经过酸洗脱和竞争洗脱的多轮筛选方法，筛选得到针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽。本发明专利技术所述靶标驼源纳米抗体Nb与传统mAb相比具有分子量低、产量高、成本低的特点。本发明专利技术的筛选方法筛选得到的表位模拟肽具有高特异性和亲和力，能够作为绿色、经济、高效的OTA化学偶联全抗原替代品，不仅能够降低检测成本，同时避免了OTA及相关有毒化学品对研究者健康和环境的危害，有利于实现OTA的绿色检测。有利于实现OTA的绿色检测。有利于实现OTA的绿色检测。

【技术实现步骤摘要】
一种以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽及其筛选方法和应用


[0001]本专利技术属于免疫分析化学
，具体涉及一种以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽及其筛选方法和应用。

技术介绍

[0002]赭曲霉毒素主要由曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)等真菌产生的对人体或动物机体造成毒害作用的次级代谢产物。其中，赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)的毒性最高、分布范围最广、对农副产品污染最严重。大量研究表明，OTA可以抑制蛋白质的合成，干扰代谢途径，破坏钙的平衡，并损害人类和动物的DNA，长期接触或暴露在存在OTA的环境中具有潜在的肾毒性、肝毒性、免疫毒性、致畸性、致癌性和致突变等毒性作用风险，严重威胁着人类和动物有机体的健康。与此同时，OTA的化学稳定性和热稳定性高，日常对农产品的加工处理难以将其完全除去。因此，开发快速、灵敏的OTA检测技术对于支持食品安全监管是非常必要的。
[0003]随着当代仪器分析技术的发展，具有高精度和高灵敏度的色谱法已经被检测机构和政府食本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以驼源纳米抗体为靶标的针对赭曲霉毒素A的表位模拟肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将驼源纳米抗体和Ni
‑
IDA琼脂糖磁珠混合，进行第一螯合，得到第一螯合物；将所述第一螯合物和噬菌体环形七肽库混合，进行第一孵育，得到第一结合物；将所述第一结合物置于磁场分离磁珠和液体，弃上清，对剩余磁珠依次进行第一洗涤和酸洗脱，调节所述酸洗脱后的洗脱液的pH至7～8，得到第一洗脱液；采用所述第一洗脱液转染大肠杆菌后依次进行扩增、纯化和滴度测定，调节产物中噬菌体的滴度为10
12
～10
13
pfu/mL，得到第一纯化物；2)将驼源纳米抗体和Ni
‑
IDA琼脂糖磁珠混合，进行第二螯合，得到第二螯合物；将所述第二螯合物和所述第一纯化物混合，进行第二孵育，得到第二结合物；将所述第二结合物置于磁场分离磁珠和液体，弃上清，对剩余磁珠依次进行第二洗涤和采用OTA标准品进行第一竞争洗脱，得到第二洗脱液；采用所述第二洗脱液转染大肠杆菌后依次进行扩增、纯化和滴度测定，调节产物中噬菌体的滴度为10
12
～10
13
pfu/mL，得到第二纯化物；3)将驼源纳米抗体和Ni
‑
IDA琼脂糖磁珠混合，进行第三螯合，得到第三螯合物；将所述第三螯合物和所述第二纯化物混合，进行第三孵育，得到第三结合物；将所述第三结合物置于磁场分离磁珠和液体，弃上清，对剩余磁珠依次进行第三洗涤和采用OTA标准品进行第二竞争洗脱，得到第三洗脱液；采用所述第三洗脱液转染大肠杆菌后依次进行扩增和滴度测定；4)在转染有第三洗脱液的大肠杆菌的滴度平板中挑取大肠杆菌单菌落进行噬菌体克隆的扩增，得到扩增后的噬菌体培养物；5)对所述噬菌体培养物进行Phage
‑
ELISA鉴定，以阴性孔OD
450
/阳性孔OD
450
≥2.1作为阳性克隆的判断依据，鉴定得到阳性克隆并进行DNA测序，得到表位模拟肽；步骤1)中所述驼源纳米抗体的工作浓度为10～20μg/mL；步骤1)中所述噬菌体环形七肽库中噬菌体的添加量为10
11
～10
12
pfu；步骤2)中所述驼源纳米抗体的工作浓度为4～8μg/mL；步...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘星，陈润民，孙志昶，毛富婧，贺贞云，杨迅，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：