产乳糖-N-三糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种产乳糖

【技术实现步骤摘要】
产乳糖
‑
N
‑
三糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种产乳糖
‑
N
‑
三糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]LNT
‑
2(乳糖
‑
N
‑
三糖)是由乳糖与N
‑
乙酰葡萄糖胺由β1
‑
3糖苷键连接起来的三糖，分子式为C
20
H
35
NO
16
，分子量为545.49。其结构式如式一：
[0003][0004]LNT
‑
2是LNT(乳糖
‑
N
‑
四糖)、LNnT(乳糖
‑
N
‑
新四糖)等HMOs中LNT系列糖合成的前体。人乳寡糖是天然存在于母乳中的一百多种低聚糖及其衍生物，由D
‑
葡萄糖、D
‑
半乳糖、N
‑
乙酰葡萄糖胺、L
‑
岩藻糖和N
‑
乙酰神经氨酸五种基本结构构成。其在母乳中的含量大概5
‑
15g/L之间，是仅次于乳糖的第二大类碳水化合物成分和第三大营养成分，也是保证婴幼儿健康成长的重要成分之一。
[0005]目前LNT
‑
2的生产方法主要有酶法与生物合成法两种。
[0006]酶法合成LNT
‑
2主要是以尿苷二磷酸乙酰葡萄糖胺(UDP
‑
GlcNAc)为供体，乳糖为受体，在β
‑
1，3
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶(LgtA)的作用下生成LNT
‑
2。酶法合成LNT
‑
2具有反应条件简单，产物纯化方便等优点。但是酶法合成LNT
‑
2需要以价格昂贵的UDP
‑
GlcNAc作为底物，使得LNT
‑
2的生产成本较高，不利于工业化大规模生产。
[0007]生物合成法以葡萄糖或甘油为碳源与能源，通过细胞内的途径可以合成UDP
‑
GlcNAc。通过在培养基中添加乳糖，乳糖在乳糖透性酶(LacY)的作用下从培养基转运至细胞内。在细胞内过表达β
‑
1，3
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶(LgtA)，可将GlcNAc转移至乳糖上，生成LNT
‑
2。
[0008]目前国内恒鲁生物采用酶法可大量合成LNT
‑
2，但是由于成本较高，难以实现工业化生产。生物合成法目前产量较低，且少有针对乳糖
‑
N
‑
三糖生产菌株代谢途径的改造。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供的一种产乳糖
‑
N
‑
三糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法及其应用，针对上述问题，构建了以β
‑
1，3
‑
N
‑
乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因lgtA在大肠杆菌中进行LNT2合成的新途径，将lgtA克隆至pBAD
‑
hisA载体中进行过表达，并同时在lgtA前融合MBP标签以提高目的蛋白的表达量。
[0010]为了实现上述技术目的，本专利技术主要采用如下技术方案：
[0011]本专利技术提供了一种产乳糖
‑
N
‑
三糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0012](1)敲除大肠杆菌基因组中代谢乳糖的基因lacZ与lacA，敲除大肠杆菌基因组中降解L
‑
阿拉伯糖的基因簇araB
‑
araA
‑
araD，得到缺陷菌株ΔAZY+；
[0013](2)将β
‑
1,3
‑
N
‑
葡糖氨基酶基因lgtA克隆至pBAD
‑
hisA载体，并在LgtA的N端融合一个MBP标签，得到pBAD
‑
MBP
‑
lgtA质粒，所述基因lgtA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0014]ATGCAGCCGCTGGTTAGCGTTCTGATTTGTGCATATAATGTGGAAAAATACTTTGCCCAGA
[0015]GCCTGGCAGCAGTTGTTAATCAGACCTGGCGTAATCTGGATATTCTGATTGTTGATGATGG
[0016]TAGCACCGATGGCACCCTGGCAATTGCACAGCGTTTTCAAGAACAGGATGGTCGTATTCG
[0017]TATTCTGGCACAGCCTCGTAATAGCGGTCTGATTCCGAGCCTGAATATTGGTCTGGATGAA
[0018]CTGGCAAAAAGCGGTGGTGGTGGCGAATATATTGCACGTACCGATGCAGATGATATTGCA
[0019]GCACCGGATTGGATTGAAAAAATTGTGGGTGAGATGGAAAAAGATCGCAGCATTATTGCA
[0020]ATGGGTGCATGGCTGGAAGTTCTGAGCGAAGAAAAAGATGGTAATCGTCTGGCACGTCA
[0021]TCATGAACATGGTAAAATTTGGAAAAAACCGACGCGTCATGAAGATATCGCAGATTTTTT
[0022]TCCGTTTGGCAACCCGATTCATAACAACACCATGATTATGCGTCGTAGCGTTATTGATGGT
[0023]GGTCTGCGTTATAATACCGAACGTGATTGGGCAGAAGATTATCAGTTTTGGTATGATGTTA
[0024]GCAAACTGGGTCGTCTGGCCTATTATCCGGAAGCACTGGTTAAATATCGCCTGCATGCAAA
[0025]TCAGGTTAGCAGCAAATATAGCATTCGCCAGCATGAAATTGCCCAGGGTATTCAGAAAAC
[0026]CGCACGTAATGATTTTCTGCAGAGCATGGGCTTTAAAACCCGTTTTGATAGCCTGGAATAT
[0027]CGCCAGATTAAAGCAGTTGCCTATGAACTGCTGGAAAAGCATCTGCCGGAAGAAGATTTT
[0028]GAGCTGGCACGCCGTTTTCTGTATCAGTGTTTTAAACGCACCGATACACTGCCTGCCGGT
[0029]GCATGGTTAGATTT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产乳糖
‑
N
‑
三糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)敲除大肠杆菌基因组中代谢乳糖的基因lacZ与lacA，敲除大肠杆菌基因组中降解L
‑
阿拉伯糖的基因簇araB
‑
araA
‑
araD，得到缺陷菌株ΔAZY+；(2)将β
‑
1,3
‑
N
‑
葡糖氨基酶基因lgtA克隆至pBAD
‑
hisA载体，并在LgtA的N端融合一个MBP标签，得到pBAD
‑
MBP
‑
lgtA质粒，所述基因lgtA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(3)将步骤(2)的pBAD
‑
MBP
‑
lgtA质粒转入步骤(1)的缺陷菌株ΔAZY+中，获得产乳糖
‑
N
‑
三糖的大肠杆菌工程菌株。2.根据权利要求1所述的产乳糖
‑
N
‑
三糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110菌株。3.根据权利要求1或2所述的产乳糖
‑
N
‑
三糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，敲除基因lacZ、lacA和基因簇araB
‑
araA
‑
araD的方法相同，以敲除基因lacZ为例，包括如下步骤：pTarget
‑
lacZ载体构建：以pTargetF质粒为模板，用引物Tar
‑
lacZ
‑
F/Tar
‑
lacZ
‑
R进行PCR扩增，获得pTarget
‑
lacZ质粒；lacZ敲除供体DNA扩增：以大肠杆菌W3110基因组DNA为模板，分别用引物lacZ
‑
updonor
‑
F/lacZ
‑
updonor
‑
R和lacZ
‑
downdonor
‑
F/lacZ
‑
downdonor
‑
R进行PCR扩增lacZ，敲除上游供体与下游供体，以上游供体与下游供体为模板，用引物lacZ
‑
updonor
‑
F/lacZ
‑
downdonor
‑
R进行重叠延伸PCR扩增完整的lacZdonor供体DNA，回收整合的lacZdonor；lacZ基因敲除：将pCas质粒转入大肠杆菌W3110，得到pCas/W3110菌株转接至LB+L
‑
Ara+kan培养基培养，制备电转化感受态，然后加入pTarget
‑
lacZ质粒和lacZdonor，共同电转化pCas/W3110电转感受态，电转完成后立即加入LB培养基重悬，复苏后取培养物涂布于LB+Kan+Spe平板中培养，并挑单克隆用引物lacZ
‑
ver
‑
F/lacZ
‑
ver
‑
R进行验证，根据扩增片段大小判断是否发生lacZ基因敲除。4.根据权利要求3所述的产乳糖
‑
N
‑
三糖的大肠杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于，(1)当敲除基因lacZ时，pTarget
‑
lacZ载体构建中，引物Tar
‑
lacZ
‑
F/Tar
‑
lacZ
‑
R具有如下所示的序列：Tar
‑
lacZ
‑
F：actagtGACGAAGCCGCCCTGTAAACgttttagagctagaaatagcaagttaaa，如SEQ ID NO.2所示；Tar
‑
lacZ
‑
R：taaaacGTTTACAGGGCGGCTTCGTCactagtattatacctaggactgagctag；如SEQ ID NO.3所示；lacZ敲除供体DNA扩增中，引物lacZ
‑
updonor
‑
F/lacZ
‑
updonor
‑
R具有如下所示的序列：lacZ
‑
updonor
‑
F：GCGAGAACAGAGAAATAGCGGC，如SEQ ID NO.4所示；lacZ
‑
updonor
‑
R：gctcagtcctaggtataatgctagcggatctttaataaggagaaggaaaagtATGTACTATTTAAAAAACACAAACTTTTGG；如SEQ ID NO.5所示；引物lacZ
‑
downdonor
‑
F/lacZ
‑
downdonor
‑
R具有如下所示的序列：lacZ
‑
downdonor
‑
F：cgctagcattatacctaggactgagctagctgtcaaAGTGTAAAGCCTGGGGTGCC，如SEQ ID NO.6所示；
lacZ
‑
downdonor
‑
R：GCAGTGAGCGCAACGCAATT；如SEQ ID NO.7所示；lacZ基因敲除中，引物lacZ
‑
ver
‑
F/lacZ
‑
ver
‑
R具有如下所示的序列：lacZ
‑
ver
‑
F：GTATTGTAACAGTGGCCCGAAG，如SEQ ID NO.8所示；lacZ
‑
ver
‑
R：CTGGCGCCCAATACGCAAAC；如SEQ ID NO.9所示；(2)当敲除基因lacA时，pTarget
‑
lacA载体构建中，引物Tar
‑
lacA
‑
F/Tar
‑
lacA
‑
R具有如下所示的序列：Tar
‑
lacA
‑
F：actagtGTGTACAGGGTGTCCCGTAAgttttagagctagaaatagcaagttaaa，如SEQ ID NO.10所示；Tar
‑
lacA
‑
R：taaaacTTACGGGACACCCTGTACACactagtattatacctaggactgagctag；如SEQ ID NO.11所示；lacA敲除供体DNA扩增中，引物lacA
‑
updonor
‑
F/lacA
‑
updonor
‑
R具有如下所示的序列：lacA
‑
updonor
‑
F：CCGGATGCGGCTAATGTAGATC，如SEQ ID NO.12所示；lacA
‑
updonor
‑
R：GACCCGACCGGGATAAGCACTATTATTTC；如SEQ ID NO.13所示；引...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁慎键，吴结缘，肖聪，
申请(专利权)人：武汉糖智药业有限公司，
类型：发明
国别省市：