果糖脱氢酶的发酵及补液培养基、发酵培养及纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种果糖脱氢酶的发酵及补液培养基、发酵培养及纯化方法，涉及果糖脱氢酶制备技术领域。其中，用于制备果糖脱氢酶的发酵培养基，包括如下成分：8

【技术实现步骤摘要】
果糖脱氢酶的发酵及补液培养基、发酵培养及纯化方法


[0001]本专利技术涉及果糖脱氢酶制备
，具体涉及一种果糖脱氢酶的发酵及补液培养基、发酵培养及纯化方法。

技术介绍

[0002]果糖脱氢酶是一种酶(EC 1.1.99.11)，该酶能催化d
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果糖氧化生成5
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酮
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d
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果糖，是一种分子量为140kDa的三聚体膜结合蛋白。由亚基I(67kDa)、II(51kDa)和III(20kDa)组成。该酶于1981年首次纯化，是一种黄酮蛋白
‑
细胞色素C复合物。目前该酶是用微生物发酵的方式来制备，菌种为葡萄糖杆菌(Gluconobacter.SP)。该酶主要用于临床中果糖的检测。
[0003]日本学者MINORU AMEYAMA(JOURNAL 0F BACTERIOLOGY，Feb.1981，p.814
‑
823)报道了一种果糖脱氢酶的制备方法，但是该方法中，发酵工艺菌体表达量低，湿重仅2g/L，且纯化时采用2次超速离心+离子交换层析+羟基磷灰石层析+聚乙二醇浓缩+透析的方法进行纯化，纯化步骤繁琐，成本较高，而且活性仅180U/mg蛋白，活性较低。
[0004]因此，提供一种发酵工艺菌体表达量高、纯化方法简单、活性较高的果糖脱氢酶的制备方法，是本专利技术亟需解决的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供的一种果糖脱氢酶的发酵及补液培养基、发酵培养及纯化方法，旨在解决上述背景技术中存在的问题。
[0006]为了实现上述技术目的，本专利技术主要采用如下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种用于制备果糖脱氢酶的发酵培养基，包括如下成分：8
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12g/L甘油，10
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15g/L硫酸铵，0.5
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1.5g/L酵母粉，1
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3g/L磷酸二氢钾，1
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3g/L磷酸氢二钾，0.5
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1.5g/L七水硫酸镁，0.05
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0.1g/L氯化钙。
[0008]在一些实施例中，用于制备果糖脱氢酶的发酵培养基，优选为，包括如下成分：10g/L甘油，12g/L硫酸铵，1g/L酵母粉，2g/L磷酸二氢钾，2g/L磷酸氢二钾，1g/L七水硫酸镁，0.07g/L氯化钙
[0009]第二方面，本专利技术提供了一种用于制备果糖脱氢酶的补液培养基，包括如下成分：200
‑
600g/L甘油，50
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150g/L硫酸铵，1
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3g/L硫酸镁。
[0010]在一些实施例中，用于制备果糖脱氢酶的补液培养基，优选为，包括如下成分：400g/L甘油，100g/L硫酸铵，2g/L硫酸镁。
[0011]第三方面，本专利技术提供了一种果糖脱氢酶的发酵培养方法，利用如第一方面所述的发酵培养基和第二方面所述的补液培养基，包括如下步骤：
[0012]将种子液按照1％～10％接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，控制温度28℃～30℃，pH 5.0～6.0，溶氧≥30％，待溶氧快速上升至60％以上，补料速度为15g/(L*h)，补料后控制溶氧≥30％，待0D值达到15以上时停止发酵，将发酵液离心，用冰水洗涤菌泥2次，离心收集菌体。
[0013]第三方面，本专利技术提供了一种纯化果糖脱氢酶的方法，包括如下步骤：
[0014]S1：采用如权利要求3所述的发酵培养方法制备含有果糖脱氢酶的菌体；
[0015]S2：用水重悬步骤S1制备得到的菌体，破壁、离心，收集上清液，并向所述上清液中加入质量分数为1％～10％TritonX
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114，搅拌，水浴保温，离心，收集沉淀，上清液中继续加入质量分数为1％～10％TritonX
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114，重复上述操作2～4次，合并沉淀备用；
[0016]S3：将步骤S2制备得到的沉淀悬浮在溶解缓冲液中，搅拌，离心，收集上清液，备用；
[0017]S4：采用DEAE
‑
纤维素柱层析法纯化步骤S3收集得到的上清液，得到第一次洗脱液；
[0018]S5：采用分子筛层析法纯化步骤S4得到的第一次洗脱液，得到第二次洗脱液；
[0019]S6：将步骤S5得到的第二次洗脱液进行超滤浓缩，然后采用平衡缓冲液进行置换，添加辅料后进行冻干，即得果糖脱氢酶纯品。
[0020]在本专利技术的较佳实施方式中，步骤S2具体采用如下方法用水重悬步骤S1制备得到的菌体，以1000bar压力破壁2次，再以5000xg离心力，离心10min收集上清液，向所述上清液中加入质量分数为1％～10％TritonX
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114，4℃搅拌2h，37℃水浴保温10min，在10000xg离心力下，25℃离心10min，收集沉淀，备用；上清液继续加入质量分数为1％～10％TritonX
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114，重复上述操作2～4次，合并沉淀备用。
[0021]在本专利技术的较佳实施方式中，步骤S3具体采用如下方法将步骤S2制备得到的沉淀悬浮在溶解缓冲液中，4℃搅拌2～10h，在10000xg离心力下，4℃离心10min，收集上清液，备用。
[0022]在本专利技术的较佳实施方式中，步骤S4具体采用如下方法：先将DEAE
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纤维素柱用平衡缓冲液平衡5倍柱体积，然后将步骤S3收集得到的上清液加入到DEAE纤维素柱中，继续用平衡缓冲液冲洗5倍柱体积，再利用平衡缓冲液和线性洗脱液进行洗脱，收集得到第一次洗脱液
[0023]洗脱程序为：
[0024]0min，线性洗脱液为0，平衡缓冲液为100％；
[0025]40min，线性洗脱液为100％，平衡缓冲液为0。
[0026]进一步的，所述溶解缓冲液采用如下方法制备：取pH6.0的Mcllraine buffer母液50ml，稀释20倍，添加10ml Triton X
‑
100至质量分数为1％和70μlβ
‑
巯基乙醇至终浓度浓度为1mM；
[0027]所述平衡缓冲液采用如下方法制备：取pH6.0的Mcllraine buffer母液50ml，稀释20倍，添加1ml Triton X
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100至质量分数为0.1％和70μlβ
‑
巯基乙醇至终浓度浓度为1mM；
[0028]所述线性洗脱液采用如下方法制备：取pH6.0的Mcllraine buffer母液1000ml，向其中添加1ml Triton X
‑
100至质量分数为0.1％和70μlβ
‑
巯基乙醇至终浓度浓度为1mM。
[0029]在本专利技术的较佳实施方式中，步骤S5具体采用如下方法先将分子筛用平衡缓冲液平衡5倍柱体积
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10CV，然后将步骤S4得到的第一次洗脱液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于制备果糖脱氢酶的发酵培养基，其特征在于，包括如下成分：8
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12g/L甘油，10
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15g/L硫酸铵，0.5
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1.5g/L酵母粉，1
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3g/L磷酸二氢钾，1
‑
3g/L磷酸氢二钾，0.5
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1.5g/L七水硫酸镁，0.05
‑
0.1g/L氯化钙。2.一种用于制备果糖脱氢酶的补液培养基，其特征在于，包括如下成分：200
‑
600g/L甘油，50
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150g/L硫酸铵，1
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3g/L硫酸镁。3.一种果糖脱氢酶的发酵培养方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的发酵培养基和权利要求2所述的补液培养基，包括如下步骤：将种子液按照1％～10％接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，控制温度28℃～30℃，pH 5.0～6.0，溶氧≥30％，待溶氧快速上升至60％以上，利用补液培养基进行补料，补料速度为15g/(L*h)，补料后控制溶氧≥30％，待0D值达到15以上时停止发酵，将发酵液离心，用冰水洗涤菌泥2次，离心收集菌体。4.一种纯化果糖脱氢酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：采用如权利要求3所述的发酵培养方法制备含有果糖脱氢酶的菌体；S2：用水重悬步骤S1制备得到的菌体，破壁、离心，收集上清液，并向所述上清液中加入质量分数为1％～10％TritonX
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114，搅拌，水浴保温，离心，收集沉淀，上清液中继续加入质量分数为1％～10％TritonX
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114，重复上述操作2～4次，合并沉淀备用；S3：将步骤S2制备得到的沉淀悬浮在溶解缓冲液中，搅拌，离心，收集上清液，备用；S4：采用DEAE
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纤维素柱层析法纯化步骤S3收集得到的上清液，得到第一次洗脱液；S5：采用分子筛层析法纯化步骤S4得到的第一次洗脱液，得到第二次洗脱液；S6：将步骤S5得到的第二次洗脱液进行超滤浓缩，然后采用平衡缓冲液进行置换，添加辅料后进行冻干，即得果糖脱氢酶纯品。5.根据权利要求4所述的纯化果糖脱氢酶的方法，其特征在于，步骤S2具体采用如下方法：用水重悬步骤S1制备得到的菌体，以1000bar压力破壁2次，再以5000xg的离心力离心10min收集上清液，向所述上清液中加入质量分数为1％～10％TritonX
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐凯，刘姣，吴结缘，肖聪，
申请(专利权)人：武汉糖智药业有限公司，
类型：发明
国别省市：