一种新型血型抗原及其酶法合成方法技术

本发明专利技术公开了一种新型血型抗原及其酶法合成方法，采用叠氮修饰的双糖底物在岩藻糖基转移酶的作用下与岩藻糖以α

【技术实现步骤摘要】
一种新型血型抗原及其酶法合成方法


[0001]本专利技术属于血型抗原合成
，具体涉及一种新型血型抗原及其酶法合成方法。

技术介绍

[0002]人组织血型抗原广泛存在于红细胞表面，也分布于人体器官的上皮细胞、内皮细胞、分泌液等。决定簇的不同将血型抗原分为A、B、H三类，又根据不同的二糖前体每类分为六种，其中五类(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、
Ⅵ
)都是自然界中存在的。
[0003]抗原与抗体可特异性识别，拟得到纯品抗原并与合适的载体结合形成可纯化抗体的分离柱产品。
[0004]目前血型抗原的合成分为化学合成与酶法合成，化学合成5～7步可得到A、B、H抗原，但由于有副产物的产生，且某些步骤转化率不足50％，产率较低，成本较高；而酶法反应转化率高，反应时间短，绿色环保。现有酶法合成A、B抗原的方法主要依靠多种糖基转移酶在不同反应体系中进行分步合成而成，其虽具有比化学反应转化率高，但是其中间产物的制备和纯化依然繁琐。因此，本专利提供一种一锅多酶法一步合成抗原A、B的方法，最后通过一步化学还原将使之成为最终的产品。该方法简单、高效，其制备与纯化放大均实现克级以上的高纯产品制备，同时具备工业放大生产的优势，为国内提供纯化抗原抗体制备介质的原材料提供有力方案。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于提供一锅多酶法合成新型血型抗原A、B的方法，以至少解决现有技术中出现的诸多问题之一。
[0006]一种新型血型抗原，具有如下结构式：
[0007][0008]其中，R为OH或NHAc。
[0009]上述新型血型抗原的酶法合成方法，包括如下步骤：
[0010]S1.将叠氮修饰的双糖底物在岩藻糖基转移酶的作用下与岩藻糖以α
‑
1,2糖苷键连接；
[0011]S2.以产物为底物，分别在转移酶作用下转化；
[0012]S3.将叠氮修饰端还原成氨基得到新型血型抗原；
[0013]所述血型抗原中R为OH时转移酶为半乳糖转移酶；R为NHAc时，转移酶为乙酰半乳糖胺转移酶。
[0014]优选地，所述叠氮修饰的双糖底物为Lac
‑
linker N3，具有如式I的结构式：
[0015][0016]进一步地，所述步骤S1中，Lac
‑
linker N3在GDP
‑
Fuc与α
‑
1,2
‑
FucT下进行反应。
[0017]进一步地，所述步骤S2中，转移酶作用下采用Mn
2+
作为催化剂。
[0018]进一步地，所述步骤S3在氢气作用下经催化还原获得抗原。
[0019]进一步地，上述合成方法还包括血型抗原的纯化：采用固相萃取C18，用不同浓度甲醇水溶液从低到高洗脱。
[0020]本专利技术还提供以上所述酶法合成方法在工业放大生产新型血型抗原中的应用，可以应用于公斤级新型抗原A、B的合成，并能够保证较高的产率和纯度。
[0021]相比现有技术，本专利技术的有益效果至少在于：
[0022]1.本专利技术提供的方法获得的血型抗体具备理想的转化率，且副产物少；并且方法简单、高效，其制备与纯化放大均可实现克级以上高纯产品的制备可作为工业化放大理想的方案。
[0023]2.本专利技术所述新型血型抗体与各种血清抗体具备较强的特异性结合作用，可以作为目前市场上血型抗体的替换，推进了血型抗体选用的范围。
附图说明
[0024]图1为本专利技术合成路线图。
[0025]图2为本专利技术实施例H抗原制备TLC结果示图。
[0026]图3为本专利技术实施例制备A抗原
‑
N3的TLC结果示图。
[0027]图4为本专利技术实施例制备B抗原
‑
N3的TLC结果示图。
[0028]图5为本专利技术实施例还原B抗原
‑
N3的TLC结果示图。
[0029]图6为本专利技术实施例A抗原纯化后的HPLC结果示图。
[0030]图7为本专利技术实施例B抗原纯化后的HPLC结果示图。
[0031]图8为本专利技术实施例A抗原质谱图。
[0032]图9为本专利技术实施例B抗原质谱图。
具体实施方式
[0033]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合具体实施方式，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本专利技术，并不是为了限定本专利技术。
[0034]本专利技术提供了一种新型血型抗原，具有如下结构式：
[0035][0036]其中，R为OH或NHAc。
[0037]本专利技术提供了一锅多酶法合成新型血型抗原的方法，包括以下步骤：
[0038]双糖底物在岩藻糖基转移酶(FucT)的作用下与岩藻糖以α
‑
1,2糖苷键连接，得到H抗原，以H抗原为底物，在乙酰半乳糖胺转移酶(BgtA)以及半乳糖转移酶(GTB)的作用下分别得到A抗原与B抗原的N3形式，最后利用化学法将N3端还原成NH2基团形式分别得到新型血型抗原A、B。本专利技术合成方法流程图如图1所示。
[0039]所述双糖底物为Lac
‑
linker N3，结构式如式I：
[0040][0041]H抗原结构式如式II：
[0042][0043]A抗原
‑
N3如结构式III：
[0044][0045]B抗原
‑
N3如结构式IV：
[0046][0047]新型血型抗原A如结构式V：
[0048][0049]新型血型抗原B如结构式VI：
[0050][0051]原料及中间产物；Lac
‑
linker N3，GDP
‑
Fuc，UDP
‑
GalNAc，UDP
‑
Gal。
[0052]产品的制备方法：
[0053]1)由双糖底物得到H抗原
[0054]反应温度在20～40℃，金属离子为5～20mM/L Mn
2+
，10～200mM/L Lac
‑
Linker、10～200mM/L GDP
‑
Fuc与0.04～0.1g/mLα
‑
1,2
‑
FucT粗酶在弱碱性条件下反应10～20h即可得到H
‑
Antigen linker N3。注意加酶前要用NaOH将pH调至弱碱性，反应过程中需要关注pH的变化，可加入50～200mM/L pH(6～9)的Tris
‑
HCl以稳定反应体系pH。
[0055]2)酶法得到A、B抗原
‑
N3[0056]A抗原
‑
N3：反应温度为20～40℃，金属离子为5～20mM/L Mn
2+
，10～200mM/L L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型血型抗原，其特征在于，具有如下结构式：其中，R为OH或NHAc。2.权利要求1所述新型血型抗原的酶法合成方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将叠氮修饰的双糖底物在岩藻糖基转移酶的作用下与岩藻糖以α
‑
1,2糖苷键连接；S2.以产物为底物，分别在转移酶作用下转化；S3.将叠氮修饰端还原成氨基得到新型血型抗原；所述血型抗原中R为OH时转移酶为半乳糖转移酶；R为NHAc时，转移酶为乙酰半乳糖胺转移酶。3.根据权利要求2所述的酶法合成方法，其特征在于，所述叠氮修饰的双糖底物为Lac
‑
linker N3，具有如式I的结构式：4.根据权利要求3所述的酶法合成方法，其特征在于，所述步骤S1中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖聪，丁冯玲，谷子瑞，屈慧荣，
申请(专利权)人：武汉糖智药业有限公司，
类型：发明
国别省市：