一种酶法合成Gal-G2-CNP的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种酶法合成Gal

【技术实现步骤摘要】
一种酶法合成Gal
‑
G2
‑
CNP的方法及应用


[0001]本专利技术涉及淀粉酶检测试剂合成
，尤其涉及一种酶法合成Gal
‑
G2
‑
CNP的方法及应用。

技术介绍

[0002]血清和尿液α
‑
淀粉酶(AMY)测定作为急性胰腺炎的诊断指标已有半个多世纪。利用AMY测定的新底物Gal
‑
G2
‑
α
‑
CNP(2
‑
氯
‑4‑
硝基苯
‑
α
‑
半乳糖
‑
麦芽糖苷)，采用色团释放法，即在麦芽寡糖上接一个生色基团—氯对硝基酚(CNP)，当AMY水解底物时释放出色团，可测定色团的生成速率，推算出酶活力。该方法不受内源性葡萄糖的干扰，并且不需要使用多种工具酶，成本较低；与G3
‑
CNP(2
‑
氯
‑4‑
硝基苯
‑
麦芽三糖)及其它底物相比，在非还原性末端用半乳糖代替葡萄糖，避免了内源性葡萄糖苷酶的干扰。利用该底物作为体外诊断试剂的应用具有明显的优势和市场。
[0003]Gal
‑
G2
‑
CNP作为α
‑
淀粉酶水解底物，广泛应用于胰腺炎的临床体外诊断试剂，但是该试剂在国内的制备还处于“卡脖子”阶段，多依赖于进口。Gal
‑
G2
‑
α
‑
CNP的合成一般采用化学合成的方式，优化的合成路线路径复杂，转化率低，明显限制了其作为体外诊断试剂的应用与推广。
[0004]LgtE酶是来自于Neisseriagonorrhoeae(淋病奈瑟菌)F62株的β
‑
1,4半乳糖基转移酶，有文献报道LgtE酶能介导UDP
‑
Gal作为受体，将半乳糖转移到奈氏系列低脂糖(LOSs)的多种LOS结构中，显示了其利用长链脂糖底物的催化活性。已知不同来源的生物体内均含β
‑
1,4半乳糖基转移酶，如利用该酶作用于麦芽糖的衍生物G2
‑
CNP合成Gal
‑
G2
‑
CNP，可实现Gal
‑
G2
‑
CNP的高效合成，对于合成底物试剂Gal
‑
G2
‑
CNP的国产化具有重要的价值和意义。目前，此酶法合成路线尚未见相关报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种酶法合成Gal
‑
G2
‑
CNP的方法及应用，解决现有技术化学合成路径复杂、转化效率低等缺陷，以推动其作为体外诊断试剂的应用与推广。
[0006]鉴于此，本专利技术的方案为：
[0007]一种酶法合成Gal
‑
G2
‑
CNP的方法，由G2
‑
CNP、糖核苷酸供体UDP
‑
Gal、在LgtE酶和酶激活剂的作用下，于pH5～9，25～42℃下反应1～4h得到Gal
‑
G2
‑
CNP。
[0008]进一步地，所述LgtE酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]进一步地，编码所述LgtE酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]作为优选，所述LgtE酶的制备过程包括如下步骤：
[0011]S1.基于菌株LgtE基因密码子优化，克隆得到的LgtE基因连接表达质粒，获得重组质粒；
[0012]S2.用重组质粒转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选得到大肠杆菌工程菌；
[0013]S3.利用工程菌发酵、诱导表达获得LgtE酶蛋白。
[0014]进一步地，所述反应过程pH为7～8，温度为37℃。
[0015]进一步地，所述LgtE酶的用量为1～2g/l。
[0016]进一步地，所述G2
‑
CNP的用量为40～80mM。
[0017]作为优选，所述G2
‑
CNP的用量为40mM、80mM。
[0018]进一步地，所述酶激活剂为Mn
2+
，用量为2～12mM。
[0019]本专利技术还提供以上所述方法得到的Gal
‑
G2
‑
CNP在制备α
‑
淀粉酶检测试剂盒中的应用，Gal
‑
G2
‑
CNP在非还原性末端用半乳糖代替葡萄糖，避免了内源性葡萄糖苷酶的干扰，利用该底物作为体外诊断试剂的应用具有明显的优势和市场。
[0020]相比现有技术，本专利技术的有益效果包括但不限于：
[0021]1.本专利技术首次将LgtE酶应用于Gal
‑
G2
‑
CNP底物合成，该酶法合成具有高效、安全的优点；相比现有复杂的化学法合成，提高了转化率，且大大简化合成途径及效率。
[0022]2.本专利技术所述酶法合成的Gal
‑
G2
‑
CNP，能达到工业化量产，应用于α
‑
淀粉酶检测试剂盒的制备，对于推动其作为体外诊断试剂的应用与推广有显著意义。
附图说明
[0023]图1为本专利技术所述LgtE酶的蛋白表达和纯化结果。
[0024]图2为本专利技术所述PH对反应转化率的影响结果。
[0025]图3为本专利技术所述Mn
2+
对反应转化率的影响结果。
[0026]图4为本专利技术所述底物G2
‑
CNP浓度对转化率的影响结果。
[0027]图5为本专利技术反应产物Gal
‑
G2
‑
CNP的LC
‑
MS质谱图。
[0028]图6为本专利技术所述反应产物Gal
‑
G2
‑
CNP的HPLC检测图谱。
具体实施方式
[0029]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合具体实施方式，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本专利技术，并不是为了限定本专利技术。
[0030]本专利技术利用LgtE酶的β
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1,4半乳糖基转移酶功能，成功用于高效催化Gal
‑
G2
‑
CNP的合成，对于合成底物试剂Gal
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G2
‑
CNP的国产化具有重要的价值和意义。本专利技术采用酶法合成，利用申请人自制的麦芽糖衍生物G2
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CNP作为底物，UDP
‑
Gal作为供体，利用LgtE酶的催化合成，大大简化合成途径及转化效率，能达到工业化量产。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶法合成Gal
‑
G2
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CNP的方法，其特征在于，由G2
‑
CNP、糖核苷酸供体UDP
‑
Gal、在LgtE酶和酶激活剂的作用下，于pH 5～9，25～42℃下反应1～4h得到Gal
‑
G2
‑
CNP。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LgtE酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述LgtE酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述LgtE酶的制备过程包括如下步骤：S1.基于菌株LgtE基因密码子优化，克隆得到的LgtE基因连接表达质粒，获得重组质粒；S2.用重组质粒转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选得...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖聪，周，
申请(专利权)人：武汉糖智药业有限公司，
类型：发明
国别省市：