大肠杆菌sbcCD基因编辑制造技术

本发明专利技术公开了大肠杆菌sbcCD基因编辑，属于基因编辑技术领域，选取两个sgRNA序列特异性靶点构建pAM

【技术实现步骤摘要】
大肠杆菌sbcCD基因编辑


[0001]本专利技术属于基因编辑
，具体涉及大肠杆菌sbcCD基因编辑。

技术介绍

[0002]SbcC
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SbcD(即sbcCD)蛋白和在人类与酵母中的Mre11
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Rad50蛋白同源。这些蛋白在结构上和功能上都是比较保守的。SbcC
‑
SbcD蛋白能形成一个具有独特结构的异四聚体复合物，在atp酶和SbcD(Mre11)相互作用位点所在的SbcC(Rad50)二聚体内包含两个延伸至60nm的长螺旋线圈区域。当与SbcD二聚体结合时，这些复合物含有显著的内切酶活性，可切割DNA发夹，同时还有单链内切酶和双链3
‑
5外切酶活性。尽管具有内切酶和外切酶活性，但研究表明，大肠杆菌、酵母和人类酶的首选底物不是双链DNA末端，而是长发夹状或回文DNA结构。在大肠杆菌中，回文序列只能在缺乏SbcCD和ExoI的突变体中维持，而在日常质粒生产中，有的质粒序列中就含有较多的回文结构形成发夹结构导致在一般的菌株中可能会降低目标质粒的产量，因此本研究考虑使本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.大肠杆菌sbcCD基因编辑，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：根据GT115菌株两端缺失的基因序列选择两个sgRNA序列特异性靶点，通过sgRNA序列特异性靶点设计MI X引物，合成两段分别包括sgRNA序列特异性靶点序列的MI X片段，然后通过重组酶将载体片段和两MIX片段连接，获得pAM
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Amp
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2sgRNA质粒；步骤二：将pCas9质粒通过化学法导入大肠杆菌Stable菌株中，涂布在卡纳抗性LB平板中，以pCAS
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gRNA
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F为上游引物和pCAS
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gRNA
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R为下游引物进行菌检引物验证，获得电转感受态Stable
‑
pCas9菌株；步骤三：以GT115菌株的sbcCD基因为模板，以sbcCD
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TYB
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F为上游引物和sbcCD
‑
TYB
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R为下游引物，扩增sbcCD基因打靶片段同源臂；步骤四：将pAM
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Amp
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2sgRNA质粒和sbcCD打靶片段同源臂通过电转化法导入电转感受态Stable
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pCas9菌株中，复苏、培养，长出转化子后挑取16个转化子，以sbcCD
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JJ
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F为上游引物和sbcCD
‑
JJ
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R为下游引物进行菌检，进行基因组PCR验证；步骤五：挑取验证正确的两个转化子，接种到卡纳...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻明军，崔康乐，王维坤，赵宝顶，
申请(专利权)人：通用生物安徽股份有限公司，
类型：发明
国别省市：