一种新型靶向肿瘤PD-L1的探针制造技术

本发明专利技术公开了一种新型的

【技术实现步骤摘要】
一种新型靶向肿瘤PD
‑
L1的探针
99m
Tc标记亲合体的制备


[0001]本专利技术涉及核医学领域，更具体地，涉及靶向PD
‑
L1的探针
99m
Tc标记亲和体以及其应用。

技术介绍

[0002]世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)在《2020全球癌症报告》中显示，2020年全球新发癌症病例1929万例，其中中国占据457万例，占比23.7％，位居全球第一。研究表明，癌症的发生和发展与免疫系统监测点功能紧密联系，肿瘤细胞可表达由突变引起的异常抗原及表观遗传改变产生的癌种抗原，可以被CD8+T细胞识别为非自身。然而，癌细胞选择特异性抑制信号通路，即免疫检查点，以逃避CD8+T细胞介导的破坏。应用免疫检查点抑制剂(ICIs)阻断抑制性信号通路，能够重新激活免疫功能，实现对实体肿瘤和血液肿瘤的破坏性治疗。目前可用的免疫检查点抑制剂主要包括针对细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T
‑
lymphocyte antigen 4,CTLA
‑
4)，程序性细胞死亡蛋白(programmed cell death protein,PD
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1)及其配体(programmed cell death protein ligand1,PD
‑
L1)的单克隆抗体。
[0003]然而，单克隆抗体相对分子量大，组织渗透能力弱，循环滞留时间长，需要用较长半衰期的核素进行标记，高对比度成像只能在数天后进行，并且由于剩余的血池活性，存在假阳性结果的风险，尤其是对于PD
‑
L1等低表达水平的靶点。而亲合体是通过定向分子进化技术筛选获得的一类新型的独特的蛋白结合配体，其作用类似于抗体，但却拥有比抗体更加优越的性质。其优点有：
①
亲合体的结合位点与抗体相似且亲和力强；
②
分子量更小，不易在体内诱发免疫应答，组织穿透性好；
③
性质十分稳定，可人工合成，等。因此，亲和体分子比单克隆抗体更适用于分子成像。
[0004]放射性核素标记的药物分子显像，通过分子识别反映靶分子在人体内的表达情况。PD
‑
1/PD
‑
L1靶向核素分子探针，使用放射性单光子或正电子核素标记抗PD
‑
1/PD
‑
L1单抗或小分子，与体内PD
‑
1/PD
‑
L1特异性结合，行单光子发射计算断层显像(Single photon emission computed tomography,SPECT)或正电子发射断层显像(positron emission tomography,PET)成像，可实现全面、动态、无创监测PD
‑
1/PD
‑
L1在体内的表达。而放射性核素
99m
Tc具有合适的γ射线能(140KeV)、理想的物理半衰期(约6h)，由钼锝发生器生产，价格便宜。
99m
Tc可以通过特异性的偶联反应，利用双功能螯合剂与亲合体连接；或在亲合体的N端或C端引入半胱氨酸，通过巯基的化学反应螯合。重要的是，放射性核素
99m
Tc标记PD
‑
L1亲和体以及此专利技术的PD
‑
L1亲和体序列尚未见报道。因此，本专利研究的是一种新型的
99m
Tc
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PD
‑
L1亲合体的制备与靶向肿瘤的研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种靶向PD
‑
L1的探针
99m
Tc标记亲和体，可用于肿瘤显像剂/肿瘤治疗剂。
[0006]本专利技术通过如下技术方案来实现：
[0007]本专利技术提供一种靶向PD
‑
L1的亲和体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]根据本专利技术，所述亲和体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]根据本专利技术，所述亲和体被核素标记。所述核素可选自
68
Ga、
64
Cu、
18
F、
86
Y、
90
Y、
89
Zr、
111
In、
99m
Tc、
11
C、
123
I、
125
I、
124
I、
177
Lu、
131
I、
211
At、
153
Sm、
186
Re、
188
Re、
67
Cu、
225
Ac、
213
Bi、
212
Bi和
212
Pb中的至少一种。优选被
99m
Tc标记。
[0010]本专利技术还提供上述亲和体的制备方法。
[0011]根据本专利技术，所述制备方法包括：目的基因表达，蛋白纯化。
[0012]根据本专利技术，所述蛋白纯化的方法包括：基因表达后，超声破碎菌体，离心，取上清，过滤后上Ni
‑
NTA树脂、洗脱、过层析柱，收集洗脱液。
[0013]根据本专利技术，所述方法通过0.22μm滤膜过滤后上Ni
‑
NTA树脂，2倍柱床体积Buffer A(50mM Tris
‑
HCl,200mM NaCl,pH 8.0)平衡。上样，不同缓冲液Buffer B(50mM Tris
‑
HCl buffer,1M NaCl，5mM咪唑，pH 8.0)、Buffer C(50mM Tris
‑
HCl buffer,1M NaCl，30mM咪唑，pH 8.0)、Buffer D(50mM Tris
‑
HCl buffer,1M NaCl，45mM咪唑，pH 8.0)各10倍体积洗涤。最后用10倍体积Buffer E(50mM Tris
‑
HCl buffer,1M NaCl，60mM咪唑，pH 8.0)洗脱。收集洗脱液，透析置换为Buffer F(20mM Tris
‑
HCl，pH 7.4)，上2倍柱床体积平衡的Q
‑
Sepharose FF层析柱，用10倍Buffer G(20mM Tris
‑
HCl，0.2M NaCl，pH 7.4)洗脱，收集洗脱液。再用10倍Buffer H(20mM Tris
‑
HCl，0.5M NaCl，pH 7.4)洗脱，收集洗脱液。
[0014]根据本专利技术，所述方法还包括，核素标记的过程。核素通过特异性的偶联反应，利用双功能螯合剂与本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向PD
‑
L1的亲和体，其特征在于，所述亲和体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。优选地，所述亲和体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种被核素标记的亲和体，其特征在于，所述亲和体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。优选地，所述亲和体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。优选地，所述核素可选自
68
Ga、
64
Cu、
18
F、
86
Y、
90
Y、
89
Zr、
111
In、
99m
Tc、
11
C、
123
I、
125
I、
124
I、
177
Lu、
131
I、
211
At、
153
Sm、
186
Re、
188
Re、
67
Cu、
225
Ac、
213
Bi、
212
Bi和
212
Pb中的至少一种。优选被
99m
Tc标记。3.权利要求1或2所述亲和体的制备方法。优选地，所述制备方法包括：目的基因表达，蛋白纯化。优选地，所述蛋白纯化的方法包括：基因表达后，超声破碎菌体，离心，取上清，过滤后上Ni
‑
NTA树脂、洗脱、过层析柱，收集洗脱液。优选地，所述方法通过0.22μm滤膜过滤后上Ni
‑
NTA树脂，2倍柱床体积BufferA(50mM Tris
‑
HCl,200mM NaCl,pH 8.0)平衡。上样，不同缓冲液Buffer B(50mM Tris
‑
HCl buffer,1M NaCl，5mM咪唑，pH 8.0)、Buffer C(50mM Tris
‑
HCl buffer,1M NaCl，30mM咪唑，pH 8.0)、Buffer D(50mM Tris
‑
HCl buffer,1M NaCl，45mM咪唑，pH 8.0)各10倍体积洗涤。最后用10倍体积Buffer E(50mM Tris
‑
HCl buffer,1M NaCl，60mM咪唑，pH 8.0)洗脱。收集洗脱液，透析置换为Buffer F(20mM Tris
‑
HCl，pH 7.4)，上2倍柱床体积平衡的Q
‑
Sepharose FF层析柱，用10倍Buffer G(20mM Tris
‑
HCl，0.2M.NaCl，...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡炯，王关炼，付玉洁，
申请(专利权)人：元本珠海横琴生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：