一种CRISPR-Cas9工程噬菌粒的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种CRISPR
‑
Cas9工程噬菌粒的构建方法


[0001]本专利技术属于微生物的
，特别涉及一种CRISPR
‑
Cas9工程噬菌粒的构建方法。

技术介绍

[0002]CRISPR
‑
Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的DNA里一个称为CRISPR的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。
[0003]研究微生物组不仅表明了某些物种对人体健康的重要性，而且还揭示了传统抗菌药物缺乏杀灭特异性的不足。抗生素的使用促进了抗生素耐药性(Antimicrobial resistance，AMR)的出现，迫切需要开发针对物种的选择性抗生素，以用于操纵复杂的微生物群落。CRISPR
‑
Cas是一种在许多原核生物中发现的适应性免疫系统，可设计用于靶向细菌基因组，导致细胞死亡。
[0004]基于原核生物的获得性免疫系统研发出的CRISPR
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR
‑
Cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于该方法通过大肠杆菌CRISPR/Cas9系统的Cas蛋白行使DNA双链切割功能，使其能识别Kana抗性基因并使其双链断裂，进而消除质粒；首先构建了含Kana抗性基因N20靶点序列的pUC
‑
Kana
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1.5k载体，包含PAM区域识别的原型间隔序列(即靶点序列)、gRNA scaffold、Cas9基因部分序列等元件；再将剩余部分的Cas9基因序列与pUC
‑
Kana
‑
1.5k载体同源重组，构建了含Kana
‑
N20靶点序列、gRNA scaffold、完整Cas9基因序列的重组噬菌粒pUC
‑ꢀ
Φ：Kana。2.如权利要求1所述的CRISPR
‑
Cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于包括如下步骤：S1， pUC
‑
Φ:Kana载体构建；先进行pUC
‑
Kana
‑
1.5k载体构建，设计靶点N20，并由此搭建pUC
‑
Φ：Kana载体；其中，设计靶点N20为设计CRISPR靶点即卡那霉素(Kana)抗性基因N20序列：GCGACAATCTATCGATTGTA ， 并 结 合 同 源 臂 序 列 设 计 引 物pUC
‑
Kana
‑
F:AACAGCTATGACCATGATTACGCCTAGTGCGACAATCTATCGATTGTACATCGCCGCAGCGGTTTCAG；pUC
‑
Kana
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1.5k载体构建具体包括： 使用HindIII
‑
HF限制性内切酶和XbaI限制性内切酶对pUC119质粒载体进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定约3100bp处的条带，与N20靶点接头进行同源重组连接；S2、设计扩增引物进行PCR扩增，获得Cas9基因序列剩余部分的PCR扩增产物，获得pUC
‑
Kana
‑
3.3k片段；S3、pUC
‑
Kana
‑
1.5k载体使用HindIII
‑
HF限制性内切酶和BamHI
‑
HF限制性内切酶进行酶切，Cas9基因序列的PCR扩增产物进行凝胶电泳胶回收，然后将pUC
‑
Kana
‑
1.5k载体和pUC
‑
Kana
‑
3.3k片段进行同源重组，获得含N20靶点的pUC
‑ꢀ
Φ：Kana质粒载体；S4、制备含pks质粒感受态，使用pUC
‑
Φ：Kana质粒载体转化已制备好的含pks质粒的DH5α感受态，通过CRISPR将含Kana抗性基因pks质粒消除，制得噬菌粒pUC
‑ꢀ
Φ：Kana。3.如权利要求2所述的CRISPR
‑
Cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于S1步骤中，pUC
‑
Kana
‑
1.5k载体构建体系如下： rCutsmart Buffer10μL，HindIII
‑
HF 4μL，XbaI 4μL，pUC119质粒载体23μL，ddH2O 补足100μL，37℃反应4h；使用引物pUC
‑
Kana
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F和pUC
‑
cas1
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R(CGGTACCCGGGGATCCTCTAGACTAAAGCTTTTAAAAGAGTC)对gRNA scaffold、Cas9基因部分序列进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳回收约1500bp处的条带，反应体系如下：KOD FX Neo Buffer 18.5μL，引物(10uM)各0.5μL，模板pUC
‑
Φ0.5μL，PCR条件：94℃
‑
2min(1cycles)；98℃
‑
20sec，68℃
‑
90sec(35cycles)；68℃
‑
10min，10℃
‑
∞；将酶切后的pUC119载体与含N20的pUC
‑
Kana片段进行同源重组，体系如下：酶切后的pUC119载体约63ng，含N20的pUC
‑
Kana片段约106ng，2
×
Basic Assembly Mix 5μL，PCR仪50℃反应25min。4.如权利要求2所述的CRISPR
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Cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于S3步骤中S2步骤中，使用引物pUC
‑
Kana
‑
F和pUC
‑
cas1
‑
R对gRNA scaffold、Cas9基因部分序列进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳回收约1500bp处的条带，反应体系如下：KOD FX Neo Buffer18.5μL，引物各0.5μL，模板pUC
‑
Φ0.5μL，PCR条件：94℃
‑
2min；98℃
‑
20sec，68℃
‑
90sec(35cycles)；68℃
‑
10min，10℃
‑
∞；
所述pUC
‑
Kana
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3.3k片段扩增使用引物pC2
‑
F和pUC
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cas2
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R对剩余部分的Cas9基因序列进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳回收约3300bp处的条带，反应体系如下：赛默飞SuperFi II PCR预混液10μL，引物各0.5μL，模板pCas质粒1μL，ddH2O补足至20μL；PCR条件：98℃
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30sec(1cycles)；98℃
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10sec，68℃
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10sec，72℃
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1min40sec(35cycles)；72℃
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18min，4℃
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∞。5.如权利要求2所述的CRISPR
‑
Cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于S3步骤中，使用HindIII
‑
HF限制性内切酶和BamHI
‑
HF限制性内切酶对pUC
‑
Kana
‑
1.5k载体进行酶切，琼脂糖凝胶电泳回收约5000bp处的条带，体系如下：rCutsmart Buffer10μL，HindIII
‑
HF 4μL，BamHI
‑
HF 4μL，pUC
‑
Kana
‑
1.5载体13μL，ddH2O补足100μL，37℃反应4h；将酶切后的pUC119载体与扩增的1.5k片段进行同源重组，体系如下：酶切后的pUC119载体约63ng，含N20的pUC
‑
Kana片段约106ng，2
×
Basic Assembly Mix 5μL，50℃反应25min；将酶切后的pUC
‑
Kana
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1.5k载体与pUC
‑
Kana
‑
3.3k片段进行同源重组，体系如下：酶切后的pUC
‑
Kana
‑
1.5k载体约99ng，pUC
‑
Kana
‑
3.3k片段约232ng，2
×
EasyGeno Assembly Mix5μL，50℃反应30min。6.如权利要求2所述的CRISPR
‑
Cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于S4步骤中，同源重组产物转化全式金DH5α感受态，涂布于无菌LB+Carb培养基平板上，37℃恒温静置过夜培养；通过菌落PCR、质粒大小检测、酶切鉴定筛选阳性克隆：菌落PCR引物pC1
‑
S
‑
F3、pC2
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R，反应体系如下：1
×
Taq PCR Master Mix(Blue)7μL，引物各0.25μL，单克隆菌(溶于15μL水)3μL，PCR条件：95℃
‑
7min(1cycles)；95℃
‑
30sec，60℃
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30sec，72℃
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1min(35cycles)；72℃
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10min，10℃
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∞；菌落PCR筛选约1500bp的阳性克隆进行摇菌，使用擎科生物高纯度质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒，进行质粒大小检测。7.如权利要求4所述的CRISPR
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Cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于S2步骤中，引物pUC
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Kana
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F的引物序列为：AACAGCTATGACCATGATTACGCCTAGTGCGACAATCTATCGATTGTACATCGCCGCAGCGGTTTCAG；引物pUC
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cas1
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R的引物序列为：CGGTACCCGGGGATCCTCTAGACTAAAGCTTTTAAAAGAGTC。各片段基因序列下所示：gRNA scaffold为GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCpUC
‑
Kana
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1.5k中的Cas9基因部分序列为ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACA
AACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAG。8.如权利要求7所述的CRISPR
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Cas9工程噬菌粒的构建方法，其特征在于扩增引物pC2
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F的基因序列为：CTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGA；扩增引物pUC
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cas2
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R的基因序列为：TCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCGTCTAGATTAAGAAATAATCTTC；同时，各片段基因序列下所示：扩增的Cas9
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3.3k序列为：TTTTTTTGAATTCTCTAGAAACAATACTTAATACTATAGAATGATAACAAAATAAACTACTTTTTAAAAGAATTTTGTGTTATAATCTATTTATTAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：张帮周，徐炜，朱笑蝶，朱珏，李源涛，肖传兴，何剑全，
申请(专利权)人：上海承葛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：