【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体的，涉及一种il-15与t细胞共刺激分子抗体构成的双功能融合蛋白。
技术介绍
1、白细胞介素-15(il-15)为四个α螺旋的糖蛋白，由114个氨基酸组成，分子量为14-15kda[1]。il-15主要由树突状细胞(dendritic cells,dc)、巨噬细胞和单核细胞分泌，作用于其他细胞。il-15的受体包括il-15rα(cd215)、il-2rβ(cd122)和il-2rγ(cd132)。cd215主要表达在dc、巨噬细胞和单核细胞表面，il-15经细胞分泌后可以直接与cd215结合，反式提呈给表达il-2rβ和il-2rγ的t细胞和nk细胞中。il-15与受体结合后，可以磷酸化下游stat3和stat5，激活jak1和jak3信号通路[2-4]。
2、il-15主要促进t细胞和nk细胞的增殖和活化，维持淋巴细胞的稳态。il-15还能维持记忆性cd8+t细胞和效应t细胞的存活，避免t细胞产生活化诱导的细胞死亡效应(activation-induced cell death,aicd)[5]。il-15不会与il-2rα结合，不会诱导调节性t细胞(regulator t cell,treg)的增殖。
3、在肿瘤治疗中，il-15单体因其半衰期短且活性较弱在临床使用中受到很大的限制。因为il-15需要与il-15rα结合才能具有较强的亲和力，il-15与il-15rα的复合体形式也成为目前临床研究的主要使用形式。此外，il-15的突变体n72d能够进一步提高il-15的活
4、为了解决il-15造成的外周毒性问题，已有的研究主要通过将il-15与其它抗体或者多肽进行融合，改变融合蛋白的靶向性，降低il-15在外周的结合，增加其在肿瘤内细胞的结合，使得融合蛋白在肿瘤内富集，发挥il-15对免疫细胞的激活作用。例如通过rgd多肽序列与il-15/il-15rα融合，rgd多肽可以特异性结合肿瘤细胞和内皮细胞高表达的整合素αvβ3，使得融合蛋白能够在肿瘤内部富集，增加肿瘤内药物浓度，发挥il-15/il-15rα的活性[8]。考虑到il-15与il-15rα亲和力约为38pm,il-15与cd122/cd132也达到1nm[9,10]，与抗体的亲和力(10-8～10-10m)较为接近，将il-15和抗体融合后，融合蛋白的靶向性无法由抗体决定，需要降低il-15和受体之间的亲和力才能将融合蛋白更好地靶向至肿瘤内。有研究通过将il-15进行突变，将其与受体il-15rα和cd122/cd132亲和力降低，同时筛选到具有高亲和力的pd-1抗体，将pd-1抗体与il-15进行融合，将融合蛋白靶向至肿瘤内高表达pd-1的t细胞，il-15可以直接作用于肿瘤内的t细胞，发挥抗肿瘤效果[11]。除了通过突变il-15降低亲和力的方式改变融合蛋白的靶向性，还可以使用受体il-2rβ的胞外域对il-15进行封闭，并通过金属基质蛋白酶-14(matrixmetalloproteinase-14,mmp-14)能够识别的底物序列将胞外域与il-15连接，在肿瘤内mmp-14识别序列被切割，释放出il-15的活性，激活抗肿瘤免疫反应[12]。
5、经过不断改进，il-15可以有效扩增肿瘤内的cd8+t细胞和nk细胞，提高抗肿瘤反应。但是，肿瘤内往往表现出免疫抑制状态，增殖的免疫细胞很快变为耗竭状态或者器活性被肿瘤内的免疫抑制细胞抑制，无法发挥抗肿瘤效应。肿瘤微环境(tumormicroenvironment,tme)内的免疫抑制细胞主要包括肿瘤相关的巨噬细胞(tumorassociated macrophage,tam)、髓样来源的抑制细胞(myeloid-derived suppressorcells,mdsc)和tregs等[13]。如何有效地抑制这些细胞发挥免疫抑制作用也成为免疫治疗亟待解决的关键问题。肿瘤内的tregs主要通过以下几种方式抑制抗肿瘤免疫反应：1)高表达ctla-4竞争dc表达的cd80和cd86；2)高表达cd25与效应t细胞竞争il-2；3)分泌抑制性的细胞因子如tgf-β、il-10等抑制效应t细胞功能；4)调节色氨酸和腺苷的代谢水平抑制效应t细胞的功能[14]。肿瘤内tregs/cd8+t细胞比例的增加往往与预后不良相关，虽然有部分癌症类型的较为特殊，但在大部分的癌症类型中tregs的数量增加不利于抗肿瘤免疫反应。因此，有效清除肿瘤内的tregs的同时不影响外周tregs，可以有效增强抗肿瘤免疫反应。
6、肿瘤微环境中的tregs往往高表达cd25、ctla-4、icos、ox40、ccr4和ccr8，针对这些分子的抗体往往被用于删除tregs。其中一些分子如cd25、ctla-4虽然在瘤内的tregs中高表达，但是在效应t细胞上也会短暂性的高表达，使用相应的抗体删除tregs的同时会删除效应t细胞，造成抗肿瘤效果大大下降。使用针对合适的标记分子的抗体来选择性删除肿瘤内的tregs成为打破tregs诱导的免疫耐受的关键。
7、肿瘤坏死因子受体超家族成员(tumor necrosis factor receptorsuperfamily,tnfrsf)中的icos、ox40、gitr和4-1bb等往往在tregs上呈组成型表达，在肿瘤内上调表达。这些分子日益受到关注，最初这些靶点的抗体往往被用于激活共刺激分子来激活t细胞，虽然也有研究表明针对这些分子的抗体可以被用于删除tregs，但还未有临床试验用于tregs的删除。
8、4-1bb分子在tregs和dc上呈组成型表达，在t细胞和nk细胞中呈诱导型表达。在t细胞中，tcr刺激或cd3信号可以诱导4-1bb的表达上调，与tcr信号产生协同作用，促进t细胞分泌il-2、ifn-γ的分泌及t细胞的增殖[15]。进一步研究表明，4-1bb共刺激除了能够诱导效应细胞产生效应因子外，还有利于记忆性t细胞和效应细胞的分化，保护t细胞免于凋亡[16]。在肿瘤内，4-1bb分子在t细胞和nk细胞中都上调表达，尤其是在tregs中高表达，其中，4-1bb分子在th1 cd4+t细胞和tregs中的功能尚不明确。4-1bb信号的激活有助于活化nk细胞，增强其adcc和细胞毒作用[17]。此外，4-1bb分子在tregs的高表达，使其成为有效减少和清除瘤内tregs的重要靶点，为免疫本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种IL-15与T细胞共刺激分子抗体构成的双功能融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括：
2.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述的第二连接片段为：2-5个G4S连接单元；优选的，所述的第二连接片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.根据权利要求1-4任一所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述的双功能融合蛋白包括：
5.根据权利要求4所述的双功能融合蛋白，其特征在于，
6.根据权利要求5所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述人IgG1的Fc区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3，所述敲除ADCC效应的人IgG1的Fc区变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.根据权利要求4所述的双功能融合蛋白，其特征在于，IL-15和IL-15R Sushi结构域为人源或鼠源蛋白；优选的，
8.编码权利要求1-7任一所述的双功能融合蛋白的核苷酸片段、含有该核苷酸片段的载体、宿主。
9.权利要求1-7任一所
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，
...【技术特征摘要】
1.一种il-15与t细胞共刺激分子抗体构成的双功能融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括：
2.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述的第二连接片段为：2-5个g4s连接单元；优选的，所述的第二连接片段的氨基酸序列如seq id no.5所示。
4.根据权利要求1-4任一所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述的双功能融合蛋白包括：
5.根据权利要求4所述的双功能融合蛋白，其特征在于，
6.根据权利要求5所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述人igg...
【专利技术属性】
技术研发人员：傅阳心，彭华，蔡月淇，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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