【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学中的基因工程，具体为一种nrf2基因干扰hepg2细胞株的构建方法及其应用。
技术介绍
1、nrf2是一种重要的转录因子，它与抗氧化应激和细胞甚至整个生物体对环境的适应性有关，其在生命体的许多领域中都具有重要作用，如癌症，心血管疾病，神经退行性疾病和代谢性疾病等。nrf2是一个很重要的参与调节的基因，作为被广泛研究的抗氧化基因之一，其功能与机体对于氧化应激反应和细胞防御紧密相关，可以调节活性氧清除剂和抗炎分子的合成及其转录和翻译后的表达。
2、目前许多研究已经表明，nrf2在预防和治疗心血管疾病、中风和癌症等方面具有积极的作用，其除了在除氧化应激和毒性的物质，同时在癌细胞生长和分裂方面也发挥了重要作用。nrf2的活化可以诱导一系列抗癌基因的表达，如细胞周期调节基因、dna修复基因以及凋亡相关的基因等，降低肿瘤细胞增殖速度和迁移能力，并抵御肝癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌等多种癌症。反之，nrf2基因的抑制则可能导致一部分原癌基因的表达，从而引起癌症细胞的快速增殖和肿瘤恶化。
3、综上，为了研究nrf2基因在癌症细胞中的具体作用以及机制，可以对宿主细胞进行nrf2基因表达量的调整，从而研究这些调整对于肿瘤细胞的的增殖速度和迁移能力的影响,hepg2细胞属于肝癌细胞，目前关于nrf2基因对hepg2细胞株影响的报道鲜有。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种nrf2基因干扰hepg2细胞株的构建方法及其应用，以弥补现有nrf2基因对
2、本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
3、一种nrf2基因干扰hepg2细胞株的构建方法，包括以下步骤：
4、步骤s1：nrf2基因的cds序列查找及三靶点设计，具体步骤如下：
5、在ncbi上查到nrf2基因的cds区域的序列，如seq id no.1所示，在所述nrf2基因的cds区域上设计三个感染靶点，如下所示：
6、nrf2-target1：agtttgggaggagctattatc
7、nrf2-target2：ccggcatttcactaaacacaa
8、nrf2-target3：gcaccttatatctcgaagttt；
9、步骤s2：三条shrna分别合成及慢病毒载体构建，具体步骤如下：
10、将s1设计的三靶点，分别添加上载体上的酶切位点和loop环结构，分别合成六个引物：
11、nrf2-shrna1-fp:gatccagtttgggaggagctattatcctcgaggataatagctcctcccaaactttttg；
12、nrf2-shrna1-rp:aattccaaaaagtttgggaggagctattatcctcgaggataatagctcctcccaaact
13、nrf2-shrna2-fp:gatccccggcatttcactaaacacaactcgagttgtgtttagtgaaatgccgtttttg
14、nrf2-shrna2-rp:aattccaaaaacggcatttcactaaacacaactcgagttgtgtttagtgaaatgccgg
15、nrf2-shrna3-fp:gatccgcaccttatatctcgaagtttctcgagaaacttcgagatataaggtgctttttg
16、nrf2-shrna3-rp:aattccaaaaagcaccttatatctcgaagtttctcgagaaacttcgagatataaggtgc；
17、将上述六个合成引物分别两两配对进行退火反应，之后4℃储存备用；将抽提好的感染慢病毒空载使用bamhi和ecori线性化之后胶回收用于后续的连接反应，配制好连接反应体系后，室温离心，于pcr仪上25℃恒温连接15分钟，连接完成之后，进行感受态转化，最终挑取单克隆进行扩增，然后进行质粒抽提之后测序，得到测序验证正确的克隆扩大进行质粒大抽，最终得到测序验证正确的大抽慢病毒质粒：
18、步骤s3：shrna慢病毒包装及感染hepg2细胞，具体步骤如下：
19、将上述测序验证正确的大抽慢病毒质粒分别进行慢病毒包装，之后进行滴度测定，最终得到慢病毒，将得到的慢病毒分别以moi为20感染hepg2细胞株；
20、步骤s4：药物筛选及干扰稳定细胞株的的构建，具体步骤如下：
21、在上述慢病毒感染的hepg2细胞株在感染72h时，使用1ug/ml的嘌呤霉素进行药物筛选，筛选72h后，对存活下来的细胞进行扩大培养，分别得到构建好的hepg2干扰细胞株；
22、步骤s5：qpcr检测nrf2基因的干扰效率，具体步骤如下：
23、上述构建好的hepg2干扰细胞株和野生型hepg2细胞株使用trizol方法进行rna提取之后，反转录成cdna之后进行qpcr检测靶点的干扰效率即可。
24、进一步地，步骤s2中退火温度为98℃，退火时间为10分钟。
25、进一步地，本专利技术还提供了一种nrf2基因干扰hepg2细胞株，应用于肝癌细胞的发病机制及治疗方法的研究。
26、本专利技术的有益效果：
27、本专利技术提供了一种nrf2基因干扰hepg2细胞株的构建方法及其应用，通过nrf2基因靶点干扰靶点设计，shrna序列合成，载体构建及抽提，慢病毒包装，慢病毒感染hepg2细胞株，药物筛选稳定细胞株构建及检测等步骤制得一种nrf2基因干扰hepg2细胞株，此构建好的细胞株中,nrf2基因的表达量相对于未做任何处理的野生型hepg2细胞株表达量明显下调，可以应用于肝癌细胞的发病机制及治疗方法的研究等领域。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种Nrf2基因干扰hepG2细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种Nrf2基因干扰hepG2细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S1中三个感染靶点，如下所示：
3.根据权利要求1所述的一种Nrf2基因干扰hepG2细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S2中六个引物，如下所示：
4.根据权利要求1所述的一种Nrf2基因干扰hepG2细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S2中退火温度为98℃，退火时间为10分钟。
5.根据权利要求1所述的一种Nrf2基因干扰hepG2细胞株的应用，其特征在于，所述Nrf2基因干扰hepG2细胞株应用于肝癌细胞的发病机制及治疗方法的研究。
【技术特征摘要】
1.一种nrf2基因干扰hepg2细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种nrf2基因干扰hepg2细胞株的构建方法，其特征在于，步骤s1中三个感染靶点，如下所示：
3.根据权利要求1所述的一种nrf2基因干扰hepg2细胞株的构建方法，其特征在于，步骤s2中六个引物，...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘登辉，李雨晴，周金山，刘欢，
申请(专利权)人：通用生物安徽股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。