本发明专利技术公开了用于腺病毒包装的pTYAd系列载体，属于分子生物学中的基因工程和分子生物学技术领域，通过以下步骤获得：对抽提好的腺病毒质粒pAD‑U6‑shRNA‑PGK‑PuroR以XbaI和SalI进行线性化，然后进行跑胶并进行胶回收，得到线性化载体pTYAd‑linear，之后在线性化载体pTYAd‑linear上引入多克隆位点序列MCS1，得到腺病毒载体pTYAd‑MCS1，之后引入MCS2序列，得到腺病毒载体pTYAd‑MCS1+MCS2，本发明专利技术通过基因序列合成，重组载体构建等步骤制得一系列腺病毒载体，可以应用于各种类型的腺病毒载体改造，对于提高腺病毒载体改造的效率具有十分重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学中的基因工程和分子生物学，具体为用于腺病毒包装的ptyad系列载体。
技术介绍
1、腺病毒是一种没有包膜的直径为70-90nm的颗粒，由252个壳粒呈20面体排列构成。衣壳里是线状双链dna分子，约含30-47kb，两端各有长约100bp的反向重复序列。
2、重组腺病毒(adv)是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。目前常用的腺病毒载体基于人腺病毒5型(ad5)，其基因组是36kb长的线性双链dna。腺病毒可通过自身的纤维(fiber)和细胞表面的受体结合被内吞进入细胞，然后从内吞体(endosome)转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。
3、重组腺病毒具有以下优点：
4、1：感染范围广，几乎可以感染所有的分裂和不分裂细胞系、原代细胞和部分组织。
5、2：感染效率高，全面超越其余病毒载体工具和脂质体转染等。
6、3：对外源基因容载能力大且不整合基因组，安全风险低。
7、重组腺病毒可以应用于基因治疗药物载体和疫苗载体，在基础生物医学研究上也受到科研工作者的青睐，因此构建方便腺病毒载体构建的载体对于满足腺病毒的各类客户需求具有十分重要的意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供腺病毒包装的ptyad系列载体，为腺病毒的临床研究提供更好的辅助工具。
>2、本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：3、用于腺病毒包装的ptyad系列载体，包括腺病毒载体ptyad-mcs1和腺病毒载体ptyad-mcs1+mcs2，具体通过以下步骤获得：
4、步骤一、对抽提好的腺病毒质粒pad-u6-shrna-pgk-puror以xbai和sali进行线性化，然后进行跑胶并进行胶回收，得到线性化载体ptyad-linear，线性化载体ptyad-linear的序列如seq id no1所示；
5、步骤二、首先合成多克隆位点序列mcs1，多克隆位点序列mcs1的序列如seq idno2所示，然后采用引物对多克隆位点序列mcs1的序列进行pcr扩增，之后对pcr产物胶回收备用；将胶回收的pcr产物与步骤一得到的线性化载体ptyad-linear使用无缝克隆试剂盒进行无缝克隆，得到正确的克隆之后，进行质粒抽提，得到构建好的腺病毒载体ptyad-mcs1，腺病毒载体ptyad-mcs1的载体全序列如seq id no3所示；
6、步骤三、将步骤二获得的腺病毒载体ptyad-mcs1以agei进行线性化之后直接进行胶回收，得到线性化载体中间产物，备用，之后将mcs2序列合成mcs2-fp、mcs2-rp引物，经过退火之后直接进行无缝克隆到线性化载体中间产物中，最终得到载体ptyad-mcs1+mcs2，载体ptyad-mcs1+mcs2的全序列如seq id no5所示。
7、作为本专利技术一种优选的技术方案，步骤一中线性化处理过程采用takara的限制性内切酶。
8、作为本专利技术一种优选的技术方案，步骤二中引物为mcs1-fp和mcs1-rp，mcs1-fp的序列为tatagtcagctctagttcaaaattttatcgttcgaactgcagtcgac，mcs1-rp的序列为tatagtcagctctagttcaaaattttatcgttcgaactgcagtcgac。
9、作为本专利技术一种优选的技术方案，步骤三中mcs2的序列如seq id no4所示。
10、作为本专利技术一种优选的技术方案，步骤三中mcs2-fp的序列为gactctagaggatccaccggtctcgagactcaagcttcgaattctgcagtcgacgagtaccccgggaccggtccgataatcaacctct。
11、作为本专利技术一种优选的技术方案，步骤三中mcs2-rp的序列为agaggttgattatcggaccggtcccggggtactcgtcgactgcagaattcgaagcttgagtctcgagaccggtggatcctctagagtc。
12、作为本专利技术一种优选的技术方案，腺病毒载体ptyad-mcs1应用于各类单启动子启动单片段或者多片段的腺病毒相关载体的改造。
13、作为本专利技术一种优选的技术方案，腺病毒载体ptyad-mcs1+mcs2应用于各类多启动子启动多片段的腺病毒相关载体的改造。
14、本专利技术的有益效果：
15、本专利技术提供了一种用于腺病毒包装的ptyad系列载体，包括腺病毒载体ptyad-mcs1和腺病毒载体ptyad-mcs1+mcs2，其中，腺病毒载体ptyad-mcs1应用于各类单启动子启动单片段或者多片段的腺病毒相关载体的改造，腺病毒载体ptyad-mcs1+mcs2应用于各类多启动子启动多片段的腺病毒相关载体的改造，本专利技术通过基因序列合成，重组载体构建等步骤制得一系列腺病毒载体，可以应用于各种类型的腺病毒载体改造，对于提高腺病毒载体改造的效率具有十分重要的意义。
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【技术保护点】
1.用于腺病毒包装的pTYAd系列载体，其特征在于，包括腺病毒载体pTYAd-MCS1和腺病毒载体pTYAd-MCS1+MCS2，具体通过以下步骤获得：
2.根据权利要求1所述的用于腺病毒包装的pTYAd系列载体，其特征在于，步骤一中线性化处理过程采用Takara的限制性内切酶。
3.根据权利要求1所述的用于腺病毒包装的pTYAd系列载体，其特征在于，步骤二中引物为MCS1-FP和MCS1-RP。
4.根据权利要求3所述的用于腺病毒包装的pTYAd系列载体，其特征在于，MCS1-FP的序列为TATAGTCAGCTCTAGttcaaaattttatcgTTCGAACTGCAGTCGAC。
5.根据权利要求3所述的用于腺病毒包装的pTYAd系列载体，其特征在于，MCS1-RP的序列为TATAGTCAGCTCTAGttcaaaattttatcgTTCGAACTGCAGTCGAC。
6.根据权利要求1所述的用于腺病毒包装的pTYAd系列载体，其特征在于，步骤三中MCS2的序列如SEQ ID NO4所示。
7.根据权利要求1所述的用于腺病毒包装的pTYAd系列载体，其特征在于，步骤三中MCS2-FP的序列如下：
8.根据权利要求1所述的用于腺病毒包装的pTYAd系列载体，其特征在于，步骤三中MCS2-RP的序列如下：
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【技术特征摘要】
1.用于腺病毒包装的ptyad系列载体，其特征在于，包括腺病毒载体ptyad-mcs1和腺病毒载体ptyad-mcs1+mcs2，具体通过以下步骤获得：
2.根据权利要求1所述的用于腺病毒包装的ptyad系列载体，其特征在于，步骤一中线性化处理过程采用takara的限制性内切酶。
3.根据权利要求1所述的用于腺病毒包装的ptyad系列载体，其特征在于，步骤二中引物为mcs1-fp和mcs1-rp。
4.根据权利要求3所述的用于腺病毒包装的ptyad系列载体，其特征在于，mcs1-fp的序列为tatagtcagctctagttcaaaattttatcgttcgaa...
【专利技术属性】
技术研发人员：施荣辉，刘登辉，周金山，
申请(专利权)人：通用生物安徽股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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