【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于工业生物，具体涉及一种固定化大肠杆菌发酵产有机酸的方法及其应用。
技术介绍
1、天眼查数据显示，我国生物发酵相关企业超1.8万家，超过50％的企业成立于5年内。2020年，我国氨基酸和有机酸市场规模分别达到500亿元和190亿元。其中，谷氨酸占42.06％，赖氨酸占36.80％，苏氨酸占12.72％，蛋氨酸占5.52％，同年氨基酸需求量高达397.76万吨。未来，随着生物科技的进步，小品种氨基酸应用领域将得到不断开发，借助饲料市场技术进步、饲料产品细分化、前沿创新药物加速研发和食品消费观念转变的大背景，高附加值小品种氨基酸将呈现出蓬勃发展的态势。
2、氨基酸和有机酸生产主要依赖于生物发酵工艺，即以玉米等淀粉质为原料，多采用大肠杆菌为生产菌种进行通气或微通气培养、并经过一定的分离纯化和结晶工艺制备获得。传统发酵生产多为游离细胞培养模式，存在细胞活性不稳定、生物转化率不高等缺陷。固定化微生物技术起始于二十世纪50年代末，由hattori等人首次实现了大肠杆菌的固定化，70年代以后，由于水污染严重，迫切需要一种高效、快速，能连续处理的废水处理技术，从而微生物固定化技术才在污水处理中得到广泛应用。目前用于大肠杆菌固定化发酵的方法主要为包埋法，即将微生物固定在海藻酸钠凝胶中使其高度密集并保持其生物活性功能，但在应用的过程中存在载体易破碎、传质效果不佳的现象，从而限制了其进一步工业化应用的可能性。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是针对现有生产工艺的不足
2、本专利技术还要解决的技术问题是上述固定化大肠杆菌发酵产有机酸的方法在产缬氨酸和d-乳酸中的应用。
3、为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
4、一种固定化大肠杆菌发酵产有机酸的方法，将大肠杆菌的种子液接种于含有固定化载体和种子培养基的固定化反应器中进行种子固定化培养使得大肠杆菌菌种固定于固定化载体上，再进行单批次固定化补料发酵，最后进行间歇式固定化补料发酵生产有机酸。
5、其中，所述的固定化载体为改性载体。
6、具体的，所述的改性载体，其在固定化反应器内的装填密度为3-30g/l。
7、进一步的，所述的改性载体按如下方法制备得到：将载体置于用ph 8-8.5tris-hcl缓冲液溶解的10-50g/l聚乙烯亚胺溶液中，溶液温度30-60℃，浸泡处理1-4小时后，纯水清洗，再经55-80℃烘干处理，得到改性载体；其中，所述的载体为合成纤维，在一些实施例中，优选合成纤维中的棉纤维。
8、其中，所述的单批次固定化补料发酵和间歇式固定化补料发酵过程中，调控发酵产物有机酸的浓度为有机酸极限浓度的60-75％。
9、具体的，所述的有机酸极限浓度按如下方法测定：将大肠杆菌种子液按10-15％v/v的接种量转接至含有50-70％v/v发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，当葡萄糖浓度降至0.2-0.5g/l时，流加第二糖液使得葡萄糖浓度维持在0.2-0.5g/l，期间当发酵罐中发酵液体积超过70-80％v/v时，排出超出的部分发酵液，每隔3个小时检测一次产物有机酸浓度，当有机酸浓度增长率连续两次不高于2-3％时，停止发酵，最后一次测定的有机酸浓度即为有机酸极限浓度；其中，所述的第二糖液，其配方包括葡萄糖500-700g/l。
10、其中，所述的有机酸包括缬氨酸、d-乳酸、丙氨酸、苏氨酸、l-乳酸中的任意一种或几种的组合，优选缬氨酸或者d-乳酸。
11、在本专利技术的一些实施例中，所述的发酵产物为缬氨酸或d-乳酸，其极限浓度分别为100g/l左右和94g/l左右，优选调控的缬氨酸浓度为65-75g/l，调控的d-乳酸浓度为55-65g/l。
12、其中，所述的大肠杆菌不限于大肠杆菌分类下的特定菌株，现有技术中用来生产有机酸的大肠杆菌均适用于本专利技术。在本专利技术的一些实施例中，所述的发酵产缬氨酸的大肠杆菌为atcc 8739，购于美国细胞培养物收藏中心；所述的发酵产d-乳酸的大肠杆菌为cgmcc 25786，该菌株购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
13、其中，所述的种子固定化培养，为将所述的种子液转接至装有50-70％v/v种子培养基的固定化反应器中进行培养，当葡萄糖浓度降至0.2-0.5g/l时，流加第一糖液和氮源培养基使得葡萄糖浓度维持在0.2-0.5g/l且总氨氮浓度维持在0.5-1g/l，当流加的总糖质量达到培养液体积的40-60g/l时，种子固定化培养结束。
14、具体的，所述的转接，其接种量为2-25％v/v。在一些实施例中，优选接种量为10-15％v/v；其中，接种量的计算以种子培养基为基准。
15、具体的，所述的第一糖液配方为葡萄糖200-700g/l；所述的氮源培养基配方为：有机氮物质10-100g/l、无机氮物质20-100g/l，溶剂为水。
16、具体的，所述的培养，其培养条件：温度35-45℃、氨水控制ph 6.5-7.5、通气量0.3-0.8vvm、罐压0.02-0.06mpa、转速150-650rpm，溶氧不低于20-30％。
17、其中，所述的单批次固定化补料发酵为：待种子固定化培养结束后，排出50-90％v/v的培养液，补入新鲜的发酵培养基进行发酵，当葡萄糖浓度降至0.2-0.5g/l时，流加第二糖液以维持葡萄糖浓度在0.2-0.5g/l，发酵至有机酸浓度达到有机酸极限浓度的60-75％时，将第二糖液切换成第三糖液继续流加以维持葡萄糖浓度在0.2-0.5g/l；期间当固定化反应器中发酵液体积超过70-80％v/v时，排出超出的部分发酵液；当第三糖液流加速率下降20-30％时，结束单批次固定化补料发酵。
18、具体的，所述的单批次固定化补料发酵，其发酵条件：温度32-45℃、氨水控制ph6.5-7.5、通气量0.1-0.8vvm、罐压0.02-0.06mpa、转速40-650rpm，溶氧不低于20-30％；
19、具体的，所述的第二糖液，其配方包括葡萄糖500-700g/l；其中，根据目标产物有机酸的不同，第二糖液会额外补充营养物质。
20、具体的，所述的第三糖液，其配方包括葡萄糖，其中，葡萄糖浓度根据如下公式计算得到：第三糖液葡萄糖浓度＝有机酸极限浓度×n％÷有机酸理论转化率，n＝60-75；其中，根据目标产物有机酸的不同，第三糖液会额外补充营养物质。
21、其中，所述的间歇式固定化补料发酵为，待单批次固定化补料发酵结束后，重复如下操作2-15个批次：排出成熟醪，补充新鲜的发酵培养基进行发酵，当葡萄糖浓度降至0.2-0.5g/l时，流加第二糖液以维持葡萄糖浓度在0.2-0.5g/l，发酵至有机酸浓度达到有机酸极限浓度的60-75％时，将第二糖液切换成第三糖液继续流加以维持葡萄糖浓度本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种固定化大肠杆菌发酵产有机酸的方法，其特征在于，将大肠杆菌的种子液接种于含有固定化载体和种子培养基的固定化反应器中进行种子固定化培养使得大肠杆菌菌种固定于固定化载体上，再进行单批次固定化补料发酵，最后进行间歇式固定化补料发酵生产有机酸；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有机酸包括缬氨酸、D-乳酸、丙氨酸、苏氨酸、L-乳酸中的任意一种或几种的组合，优选缬氨酸或者D-乳酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的改性载体，其在固定化反应器内的装填密度为3-30g/L；所述的改性载体按如下方法制备得到：将载体置于用pH 8-8.5Tris-HCL缓冲液溶解的10-50g/L聚乙烯亚胺溶液中，30-60℃浸泡1-4小时后，纯水清洗，再经55-80℃烘干，得到改性载体；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有机酸极限浓度按如下方法测定：将大肠杆菌种子液按10-15％v/v的接种量转接至含有50-70％v/v发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，当葡萄糖浓度降至0.2-0.5g/L时，流加第二糖液使得葡萄糖浓度维持在
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的种子固定化培养，为将所述的种子液转接至装有50-70％v/v种子培养基的固定化反应器中进行培养，当葡萄糖浓度降至0.2-0.5g/L时，流加第一糖液和氮源培养基使得葡萄糖浓度维持在0.2-0.5g/L且总氨氮浓度维持在0.5-1g/L，当流加的总糖质量浓度达到40-60g/L时，种子固定化培养结束；
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单批次固定化补料发酵为：待种子固定化培养结束后，排出50-90％v/v的培养液，补入新鲜的发酵培养基进行发酵，当葡萄糖浓度降至0.2-0.5g/L时，流加第二糖液以维持葡萄糖浓度在0.2-0.5g/L，发酵至有机酸浓度达到有机酸极限浓度的60-75％时，将第二糖液切换成第三糖液继续流加以维持葡萄糖浓度在0.2-0.5g/L；期间当固定化反应器中发酵液体积超过70-80％v/v时，排出超出的部分发酵液；当第三糖液流加速率下降20-30％时，结束单批次固定化补料发酵；
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的间歇式固定化补料发酵为，待单批次固定化补料发酵结束后，重复如下操作2-15个批次：
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定化反应器包括：发酵罐(1)、搅拌桨(2)、模块化载体框架(3)和气体分布器(4)；
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的发酵罐(1)，其高径比为1.4-2.2，优选高径比为2。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的搅拌桨(2)分为四层桨叶，从上至下，第一至第三层为3叶斜叶桨，第四层为6叶平叶桨，相邻的桨叶之间沿纵向设置；
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的模块化载体框架(3)包括不分段锯齿状载体框架(3-1)、分段锯齿状载体框架(3-2)、无切线夹角的放射状载体框架(3-3)和有切线夹角的放射状载体框架(3-4)中的任意一种；优选有切线夹角的放射状载体框架(3-4)。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的不分段锯齿状载体框架(3-1)是由2片以上V形钢丝网沿周向首尾相连而成的；
13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的气体分布器(4)为单层或双层环形，最外层环形其直径是发酵罐(1)直径的1/5-1/2，孔径1-5mm。
14.权利要求1-13任意一项所述的方法在发酵产缬氨酸中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述的发酵产缬氨酸，
16.权利要求1-13任意一项所述的方法在发酵产D-乳酸中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的发酵产D-乳酸，
...【技术特征摘要】
1.一种固定化大肠杆菌发酵产有机酸的方法，其特征在于，将大肠杆菌的种子液接种于含有固定化载体和种子培养基的固定化反应器中进行种子固定化培养使得大肠杆菌菌种固定于固定化载体上，再进行单批次固定化补料发酵，最后进行间歇式固定化补料发酵生产有机酸；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有机酸包括缬氨酸、d-乳酸、丙氨酸、苏氨酸、l-乳酸中的任意一种或几种的组合，优选缬氨酸或者d-乳酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的改性载体，其在固定化反应器内的装填密度为3-30g/l；所述的改性载体按如下方法制备得到：将载体置于用ph 8-8.5tris-hcl缓冲液溶解的10-50g/l聚乙烯亚胺溶液中，30-60℃浸泡1-4小时后，纯水清洗，再经55-80℃烘干，得到改性载体；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有机酸极限浓度按如下方法测定：将大肠杆菌种子液按10-15％v/v的接种量转接至含有50-70％v/v发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，当葡萄糖浓度降至0.2-0.5g/l时，流加第二糖液使得葡萄糖浓度维持在0.2-0.5g/l，期间当发酵罐中发酵液体积超过70-80％v/v时，排出超出的部分发酵液，每隔3个小时检测一次产物有机酸浓度，当有机酸浓度增长率连续两次不高于2-3％时，停止发酵，最后一次测定的有机酸浓度即为有机酸极限浓度；
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的种子固定化培养，为将所述的种子液转接至装有50-70％v/v种子培养基的固定化反应器中进行培养，当葡萄糖浓度降至0.2-0.5g/l时，流加第一糖液和氮源培养基使得葡萄糖浓度维持在0.2-0.5g/l且总氨氮浓度维持在0.5-1g/l，当流加的总糖质量浓度达到40-60g/l时，种子固定化培养结束；
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单批次固定化补料发酵为：待种子固定化培养结束后，排出50-90％v/v的培养液，补入新鲜的发酵培养基进行发酵，当葡萄糖浓度降至0.2-0.5g/l时，流加第...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈勇，刘庆国，应汉杰，孙文俊，梁偲策，温庆仕，柳东，高勇，
申请(专利权)人：南京高新工大生物技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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