一株过表达Bem3基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一株过表达Bem3基因的酿酒酵母基因工程菌，该菌株由原始酿酒酵母的Bem3基因过表达后改造得到。过表达Bem3基因的酿酒酵母基因工程菌对比原始酿酒酵母菌株在游离发酵过程中絮凝能力显著增强，在固定化发酵过程中生物膜形成能力增强，提高了乙醇产量，缩短了发酵周期，底物抗逆性有明显增加，能耐受高温、高糖环境，抗渗透压能力也得到了增强。抗渗透压能力也得到了增强。抗渗透压能力也得到了增强。

【技术实现步骤摘要】
一株过表达Bem3基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程及微生物
，具体涉及一株过表达Bem3基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]芽位点的形成是酿酒酵母有丝分裂事件中重要的一步，Bem3蛋白在酿酒酵母芽位点的形成过程中扮演重要的作用。有数据表明，不同细胞周期事件与酿酒酵母生物膜的形成能力之间存在一定的关系。
[0003]生物膜也称为生物被膜，是一种由微生物细胞和其分泌的胞外基质共同组成的生物聚集体，由微生物集群与其分泌出的多糖、蛋白、脂肪酸等形成膜状结构附着于载体表面。生物膜的存在，不仅作为屏障为细胞的生命活动创造了稳定的内环境，介导了细胞与细胞、细胞与基质之间的连接，而且还承担了物质转运、信息的跨膜传递和能量转换等功能，更重要的是，生物膜还作为一种重要的工业应用——固定化发酵。与游离细胞发酵相比，固定化发酵中所形成的生物膜能在发酵过程中表现出较高的底物耐受性和较快的发酵效率。
[0004]因此本专利技术选取Bem3基因作为改造对象，构建酿酒酵母基因工程菌，以期增加酿酒酵母S288C生物被膜的形成能力和底物抗逆性，提高乙醇发酵的生产能力和生产效率。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一株过表达Bem3基因的酿酒酵母基因工程菌，以提高酿酒酵母抗逆性和发酵生产乙醇的能力。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的构建方法。
[0007]本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的应用。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
[0009]一株过表达Bem3基因的酿酒酵母基因工程菌，该菌株由原始酿酒酵母的Bem3基因过表达后改造得到，所述Bem3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]其中，所述原始酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae S288C，来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 1308，可商购获得。
[0011]上述酿酒酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
[0012](1)以Saccharomyces cerevisiae S288C基因组DNA为模板，扩增出Bem3目的基因片段；
[0013](2)利用限制性内切酶获得线性化质粒pYX212，将Bem3目的基因片段与线性化质粒pYX212导入大肠杆菌DH5α中，获得DH5α
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pYX212
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Bem3菌株，提取所获得的目标大肠杆菌的质粒；
[0014](3)将步骤(2)得到的质粒转化至酿酒酵母感受态中，即得过表达酿酒酵母基因工程菌。
[0015]其中，步骤(1)中，扩增Bem3基因片段所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
[0016]其中，步骤(2)中，所述的限制性内切酶为Sac I。
[0017]其中，步骤(2)中，用限制性核酸内切酶对所获得的目标大肠杆菌的质粒进行酶切验证，利用凝胶电泳对取得质粒进行可视化初筛。
[0018]其中，步骤(3)中，利用含有500μg/mL G418的YPD培养基筛选获得的阳性转化子，得到过表达Bem3基因的酿酒酵母基因工程菌S288C
‑
pBem3。
[0019]上述过表达Bem3的酿酒酵母基因工程菌在提高酿酒酵母抗逆性中的应用也在本专利技术的保护范围之内。
[0020]其中，所述的抗逆性为底物抗逆性。具体的，改造后的菌株抗渗透压能力更强，对高浓度底物的耐受力更强，且对高温的耐受性更强。
[0021]上述过表达Bem3的酿酒酵母基因工程菌在发酵制备乙醇中的应用也在本专利技术的保护范围之内。
[0022]其中，所述的酿酒酵母基因工程菌的种子液按照5％～20％的体积比接种于发酵培养基中；优选为按照10％的体积比。
[0023]其中，所述的发酵，其发酵方式分为游离发酵和固定化发酵，优选的发酵方式为固定化发酵。
[0024]具体的，所述得固定化发酵，以天然有机载体、人工合成高分子载体、人工无机高分子材料、复合材料作为固定化介质；优选的固定化介质为天然有机载体，更优选的固定化介质为天然有机载体中的棉纤维材料。
[0025]其中，所述的固定化介质，其浓度为10～70g/L，优选为40g/L。
[0026]其中，所述的发酵条件为：发酵温度28℃
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40℃，发酵时间为20
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30h；优选的发酵温度为30℃和/或35℃，发酵时间为30h。
[0027]其中，所述的发酵，其发酵培养基配方如下：100g/L葡萄糖，3
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6g/L蛋白胨、0.1
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1g/L硫酸铵、3
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6g/L磷酸二氢钾、3
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6g/L酵母膏、0.01
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1g/L硫酸镁、0.01
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1g/L七水合硫酸亚铁、0.01
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1g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
[0028]优选的，所述发酵培养基配方如下：60g/L葡萄糖，4g/L蛋白胨、0.5g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、3g/L酵母膏、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L七水合硫酸锌，溶剂为水；或发酵培养基：100g/L葡萄糖，6g/L蛋白胨、0.5g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、5g/L酵母膏、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L七水合硫酸锌，溶剂为水。
[0029]有益效果：本专利技术构建了一株过表达Bem3基因的酿酒酵母基因工程菌，由于原始菌株S288C在发酵初期生物被膜形成缓慢，导致发酵周期加长，而过表达Bem3基因的酿酒酵母增强了酿酒酵母S288C生物被膜的形成能力，提高了乙醇产量，缩短了发酵时间，提高了菌株的底物抗逆性，能耐受高温、高糖环境，抗渗透压能力也得到了增强。
附图说明
[0030]图1为实施例1中Bem3基因片段的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：DNA分子量marker，Bem3：Bem3基因片段(3387bp)。
[0031]图2为实施例1中DH5α
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pYX212
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Bem3质粒的酶切鉴定电泳图，其中，M：DNA分子量
marker；W为原始质粒对照组，1、2、3、4分别为两个质粒酶切组(3387bp)。
[0032]图3为实施例2中原始菌株(S288C)与Bem3基因过表达菌株(S288C
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pBem3)在96孔板培养1天孔板染色脱色图。
[0033]图4为实施例3中原始菌株(S288C)与Bem3基因过表达菌株(S288C
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pBem3)在游离发酵与固定化发酵的发酵残糖数据；其中，W：原始菌株游离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株过表达Bem3基因的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，该菌株由原始酿酒酵母的Bem3基因过表达后改造得到，所述Bem3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述原始酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae S288C。3.权利要求1或2所述的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以Saccharomyces cerevisiae S288C基因组DNA为模板，扩增出Bem3目的基因片段；(2)利用限制性内切酶获得线性化质粒pYX212，将Bem3目的基因片段与线性化质粒pYX212导入大肠杆菌DH5α中，获得DH5α
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pYX212
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Bem3菌株，提取所获得的目标大肠杆菌的质粒；(3)将步骤(2)得到的质粒转化至酿酒酵母感受态中，即得过表达酿酒酵母基因工程菌。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述限制性内切酶为SacI。5.权利要求1或2所述的过表达Bem3的酿酒酵母基因工程菌在提高酿酒酵母抗逆性中的应用。6.权利要求1或2所述的过表达Bem3的酿酒酵母基因工程菌在发酵制备乙醇中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的发酵，其发酵方式分为游离发酵和固定化发酵，优选的发酵方式为固定化发酵。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，李国雄，陈勇，刘庆国，柳东，刘桂文，温庆仕，
申请(专利权)人：南京高新工大生物技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：