【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种胞苷激酶突变体及其应用。
技术介绍
1、胞苷酸本身用作食品添加剂、基因工程试剂及制药原料，具有促进肠胃道细胞发育和改善肠、胃道微生态的作用，还具有抗病毒、抗肿瘤、增强淋巴细胞免疫功能和抑制核酸代谢的作用，还是生产胞磷胆碱、三磷酸胞苷等核苷酸类药物的中间体原料。以胞苷为原料，可通过胞苷激酶udk(cytidine kinase,ec 2.7.1.213)催化合成胞苷酸。然而，在胞苷酸的生产过程中，工业催化环境大幅降低了催化酶的活性，当在35℃环境下保存时间超过5h时，胞苷激酶udk(cytidine kinase,ec 2.7.1.213)活性降低了50％以上。为了增加该酶在工业催化环境下的稳定性，提高胞苷酸的转化率，需要构建了一种稳定性能得到强化的胞苷激酶，以便更好的应用于胞苷酸的制备中。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，通过在野生型胞苷激酶蛋白表面引入半胱氨酸，构建一种胞苷激酶突变体，使其在空间结构上相邻的氨基酸残基形成二硫键，增强蛋白三维结构的稳定性。
2、本专利技术还要解决的技术问题是提供上述胞苷激酶突变体在制备胞苷酸中的应用。
3、为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
4、一种胞苷激酶突变体，所述的胞苷激酶突变体的氨基酸序列，是将野生型胞苷激酶的氨基酸序列第19位赖氨酸突变为半胱氨酸，第46位亮氨酸突变为半胱氨酸，第124位甘氨酸突变为半胱氨酸，第
5、具体的，所述的突变为k19c，l46c，l124c，p175c，e195c。
6、其中，所述的野生型胞苷激酶来源于嗜热栖热菌thermus thermophilus，其氨基酸序列如seq id no：1所示，对应的编码野生型胞苷激酶的核苷酸序列如seq id no：2所示。
7、其中，所述的胞苷激酶突变体，其氨基酸序列如seq id no：3所示。
8、其中，编码胞苷激酶突变体的核苷酸序列如seq id no：4所示。
9、一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含上述编码胞苷激酶突变体的核苷酸序列。
10、其中，所述表达载体可以是本领域常规的各种质粒载体，只要所述的重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达即可。优选的表达载体为pet28a，其是通过提取e.coli dhsα/pet28a(购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)质粒，再经酶切、分离回收、纯化得到的。
11、一种重组表达转化体，含有上述重组表达载体或上述胞苷激酶突变体的核苷酸序列。通过将上述构建好的重组表达载体转化至宿主细胞制备得到的。
12、其中，所述的宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地进行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达目标蛋白质即可。优选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)(购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)。
13、在适于胞苷激酶突变体表达的条件下培养所述的重组表达转化体后，离心收集胞苷激酶突变体菌体。
14、具体的，将菌株在含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb平板上划线，37℃培养12h。挑取单菌落至50ml离心管(含10％v/v加入50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基)，37℃，220rpm培养12h。然后以10％v/v的接种量接种到1l摇瓶(含25％v/v加入50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基)，37℃，220rpm培养至od600为0.8时，加入iptg至终浓度为0.2mm，降低温度至30℃，200rpm，再持续培养10h以诱导表达，离心并收集菌体用于后续催化反应。
15、在本专利技术的一些实施例中，将获得的胞苷激酶突变体菌体进行酶活检测，测定方法如下：50ml酶活测定体系含有30mm胞苷，100mm mgcl2·6h2o，30mm atp，10g/l二甲苯，20g/l胞苷激酶突变体，在35℃下以750rpm搅拌反应混合物1h，并通过添加5mol/l碱溶液将反应ph维持在7.5，分别置于35℃环境保存5h和10h，检测各环境下胞苷激酶突变体的酶活(以野生型胞苷激酶为对照)。其中，所述的酶活，其定义为：30-37℃，ph＝7-8条件下，优选为在35℃，ph 7.5条件下，每分钟产生1μmol cmp(胞苷酸)所需的酶量。
16、具体的，所述的胞苷激酶突变体在35℃工业催化环境下保存5h、10h，其酶活活性比野生型胞苷激酶的酶活活性分别提高了36.5％、93.8％。
17、上述胞苷激酶突变体在催化合成胞苷酸中的应用也在本专利技术所保护的范围之内。
18、即以胞苷为底物，以atp作为辅助底物，通过胞苷激酶突变体催化胞苷合成胞苷酸。
19、其中，所述的催化合成，其催化体系包括：80-150mm胞苷，30-80mm mgcl2·6h2o，80-150mm atp，5-15g/l二甲苯，50-150g/l胞苷激酶突变体；优选为：100mm胞苷，50mmmgcl2·6h2o，100mm atp，10g/l二甲苯，100g/l胞苷激酶突变体。
20、其中，所述的催化合成，其反应条件为：30-37℃、500-1000rpm、ph＝7-8；优选为35℃、750rpm、ph＝7.5下，反应10h或15h。
21、具体的，所述的胞苷激酶突变体在35℃工业环境下催化反应5h、10h和15h，胞苷激酶突变体的胞苷转化率在后期明显高于野生型胞苷激酶，在反应10h、15h后，其胞苷转化率比野生型胞苷激酶分别提高了31.9％、46.9％。
22、有益效果：与现有技术相比，本专利技术构建了一种稳定性得到强化的胞苷激酶突变体，相较于野生型胞苷激酶，其在以胞苷为原料催化合成胞苷酸的工业催化环境下的适应能力更强，可在催化反应温度下长时间保持活性状态，从而保证了催化体系的稳定性并提高了生成胞苷酸的效率，可以更好的满足工业生产的需求，因而具有广阔的应用前景。
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1.一种胞苷激酶突变体，其特征在于，所述的胞苷激酶突变体的氨基酸序列，是将野生型胞苷激酶的氨基酸序列第19位赖氨酸突变为半胱氨酸，第46位亮氨酸突变为半胱氨酸，第124位甘氨酸突变为半胱氨酸，第175位脯氨酸突变为半胱氨酸，第195位的谷氨酸突变为半胱氨酸得到的。
2.根据权利要求1所述的胞苷激酶突变体，其特征在于，所述的野生型胞苷激酶来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1所述的胞苷激酶突变体，其特征在于，所述的胞苷激酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求1所述的胞苷激酶突变体，其特征在于，所述的胞苷激酶突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体包含权利要求4所述的核苷酸序列。
6.一种重组表达转化体，其特征在于，含有权利要求5所述的重组表达载体或权利要求4所述胞苷激酶突变体的核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的催化合成，以胞苷为底物，以ATP作为辅助底物，通过胞苷激酶突变体催化胞苷合成胞苷酸。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的催化合成，其催化体系包括：80-150mM胞苷，30-80mM MgCl2·6H2O，80-150mM ATP，5-15g/L二甲苯，50-150g/L胞苷激酶突变体；优选为100mM胞苷，50mM MgCl2·6H2O，100mM ATP，10g/L二甲苯，100g/L胞苷激酶突变体。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的催化合成，其反应条件为：30-37℃、500-1000rpm、pH＝7-8。
...【技术特征摘要】
1.一种胞苷激酶突变体，其特征在于，所述的胞苷激酶突变体的氨基酸序列，是将野生型胞苷激酶的氨基酸序列第19位赖氨酸突变为半胱氨酸，第46位亮氨酸突变为半胱氨酸，第124位甘氨酸突变为半胱氨酸，第175位脯氨酸突变为半胱氨酸，第195位的谷氨酸突变为半胱氨酸得到的。
2.根据权利要求1所述的胞苷激酶突变体，其特征在于，所述的野生型胞苷激酶来源于嗜热栖热菌thermus thermophilus，其核苷酸序列如seq id no：1所示，对应的氨基酸序列如seq id no：2所示。
3.根据权利要求1所述的胞苷激酶突变体，其特征在于，所述的胞苷激酶突变体，其氨基酸序列如seq id no：3所示。
4.根据权利要求1所述的胞苷激酶突变体，其特征在于，所述的胞苷激酶突变体，其核苷酸序列如seq id no：4所示。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体包含权利要求4所述的核苷酸序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，王骏之，温庆仕，陈勇，
申请(专利权)人：南京高新工大生物技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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