【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种产乳酰-n-二岩藻六糖ii的工程大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物代谢工程。
技术介绍
1、母乳低聚糖(human milk oligosaccharides,hmos)作为母乳中除了乳糖和脂质外的第三大固体营养成分，它们为婴幼儿健康成长提供了不可替代的益处。相关研究表明母乳低聚糖在肠道健康如抗菌作用、肠道屏障等方面发挥了独特作用。乳糖-n-二岩藻六糖ii(lacto-n-difucohexaose ii，lndfh ii)是岩藻糖基化的人乳寡糖之一，可以通过各种纯化步骤直接从母乳中分离出来，但产量相对较低；也可以通过化学酶和细胞工厂合成，但需要添加昂贵的gdp-岩藻糖和酶，从而增加生产成本。
2、微生物合成复杂和支链hmo报道较少。2015年，等人通过重组gdp-岩藻糖挽救途径和α-1,4-岩藻糖基转移酶的额外表达，构建了lndfh ii的合成途径(synthesis of fucosylatedlacto-n-tetraose using whole-cellbiotransformation)。然而，这种方法需要以岩藻糖作为供应，增加了生产成本，且lndfhii滴度仅为547.2mg/l。为了进一步构建lndfh ii从头合成途径，2022年张涛等人(engineering escherichia coli for high-titer biosynthesis of lacto-n-difucohexaose ii)通过将lgta(β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖基转移酶)和wbgo(β-1
3、但是，现有的lndfh ii产量仍有待进一步提升以满足工业化生产需求。
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的不足，本专利技术提供了一株重组菌株，该菌株以甘油为碳源，以乳糖为底物，高效合成乳糖-n-二岩藻六糖ii(lndfh ii)。
2、本专利技术提供的第一个目的是提供一株基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌enp4l2为出发菌株，表达了α1,3/4-岩藻糖基转移酶fuct14，甘露糖1-鸟苷酸转移酶manc，磷酸甘露糖酶manb，gdp-d-甘露糖-4,6-脱水酶gmd，gdp-岩藻糖合成酶wcag，β-1,3-半乳糖基转移酶wbgo和α1,3-岩藻糖转移酶；
3、所述大肠杆菌enp4l2公开于文献engineering escherichia coli for high-level production of lacto-n-fucopentaose i by stepwise de novo pathwayconstruction中。所述大肠杆菌enp4l2以大肠杆菌bl21(de3)为出发菌株，敲除了β-半乳糖苷酶基因lacz、二磷酸尿核苷葡萄糖脱氢酶基因ugd、udp-n-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶基因wecb以及葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶基因nagb；并在大肠杆菌的基因组上的reca位点整合了来源于大肠杆菌k-12衍生菌mg1655的udp-葡萄糖4差向异构酶基因gale，同时在大肠杆菌的基因组上的is186-1、is186-2、is186-4、is186-5位点分别整合了来源于脑膜炎奈瑟菌的编码β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的基因lgta。
4、在一种实施方式中，编码所述甘露糖1-鸟苷酸转移酶manc，磷酸甘露糖酶manb，gdp-d-甘露糖-4,6-脱水酶gmd，gdp-岩藻糖合成酶wcag的基因的序列公开于专利cn112342176a中。
5、在一种实施方式中，所述α1,3/4-岩藻糖基转移酶fuct14的氨基酸序列如seq idno.1所示。
6、在一种实施方式中，所述β-1,3-半乳糖基转移酶wbgo的氨基酸序列如seq idno.2所示。
7、在一种实施方式中，所述α1,3-岩藻糖转移酶选自以下一种或多种：fuct3、bf13ft、futa、futb、fucu、futm1、futm2、hpfuct、m32；
8、所述α1,3-岩藻糖转移酶fuct3来源于幽门螺杆菌(helicobacter pylori)nctc11637，其氨基酸序列的ncbi登录号为aab93985.1，编码所述α1,3-岩藻糖转移酶fuct3的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；
9、所述α1,3-岩藻糖转移酶bf13ft来源于脆弱类杆菌(bacteroides fragilis)nctc9343，其氨基酸序列的ncbi登录号为cah09151.1，编码所述α1,3-岩藻糖转移酶bf13ft的基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；
10、所述α1,3-岩藻糖转移酶futa、futb来源于幽门螺杆菌(helicobacter pylori)26695，其氨基酸序列的ncbi登录号分别为aad07447.1、aad07710.1，编码所述α1,3-岩藻糖转移酶futa、futb的基因的核苷酸序列分别如seq id no.5、seq id no.6所示；
11、所述α1,3-岩藻糖转移酶fucu来源于幽门螺杆菌(helicobacter pylori)j99，其氨基酸序列的ncbi登录号为aad06573.1，编码所述α1,3-岩藻糖转移酶fucu的基因的核苷酸序列如seq id no.7所示；
12、所述α1,3-岩藻糖转移酶futm1来源于拟杆菌科细菌(bacteroidaceaebacterium)，其氨基酸序列的ncbi登录号为mbo5664686.1，编码所述α1,3-岩藻糖转移酶futm1的基因的核苷酸序列如seq id no.8所示；
13、所述α1,3-岩藻糖转移酶futm2来源于鸡拟杆菌(bacteroides gallinaceum)，其氨基酸序列的ncbi登录号为wp_204430034.1，编码所述α1,3-岩藻糖转移酶futm2的基因的核苷酸序列如seq id no.9所示；
14、所述α1,3-岩藻糖转移酶hpfuct来源于幽门螺杆菌(helicobacter pylori)nctc11639，其氨基酸序列的ncbi登录号为aab81031.1，编码所述α1,3-岩藻糖转移酶hpfuct的基因的核苷酸序列如seq id no.10所示；
15、所述α1,3-岩藻糖转移酶m32为：以所述α1,3-岩藻糖转移酶hpfuct为亲本，将亲本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大肠杆菌ENP4L2为出发菌株，表达了α1,3/4-岩藻糖基转移酶fucT14，甘露糖1-鸟苷酸转移酶manC，磷酸甘露糖酶manB，GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶gmd，GDP-岩藻糖合成酶wcaG，β-1,3-半乳糖基转移酶wbgO和α1,3-岩藻糖转移酶。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述α1,3/4-岩藻糖基转移酶fucT14的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述β-1,3-半乳糖基转移酶wbgO的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述α1,3-岩藻糖转移酶的氨基酸序列的NCBI登录号为AAB93985.1、MBO5664686.1或AAB81031.1，或所述α1,3-岩藻糖转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，以质粒pRSFDuet-1为载体表达所述甘露糖1-鸟苷酸转移酶manC，磷酸甘露糖酶manB、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶gmd和GDP-岩藻糖合成酶wcaG；以质粒pCDFDuet 1
4.一种生产乳糖-N-二岩藻六糖II的方法，其特征在于，所述方法包括以权利要求1-3任一所述的基因工程菌发酵生产乳糖-N-二岩藻六糖II。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1-3任一所述的基因工程菌接种至发酵培养基，待菌株生长至OD600为0.6-0.8，加入诱导剂和底物，于20-30℃生产乳糖-N-二岩藻六糖II；所述诱导剂包括IPTG；所述底物包括乳糖。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1-3任一所述的基因工程菌接种至发酵培养基，待菌株生长至OD600为20-30，加入诱导剂和底物，于20-30℃生产乳糖-N-二岩藻六糖II，并通过补料维持发酵体系中乳糖浓度为3～10g/L，甘油浓度为3～10g/L；所述诱导剂包括IPTG；所述底物包括乳糖。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述IPTG的浓度为0.1-1mM。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中含有甘油。
9.权利要求1-3任一所述的基因工程菌，或权利要求4-8任一所述方法在食品领域中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为将所述基因工程菌或所述方法用于生产乳糖-N-二岩藻六糖II或含有乳糖-N-二岩藻六糖II的产品。
...【技术特征摘要】
1.一株基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大肠杆菌enp4l2为出发菌株，表达了α1,3/4-岩藻糖基转移酶fuct14，甘露糖1-鸟苷酸转移酶manc，磷酸甘露糖酶manb，gdp-d-甘露糖-4,6-脱水酶gmd，gdp-岩藻糖合成酶wcag，β-1,3-半乳糖基转移酶wbgo和α1,3-岩藻糖转移酶。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述α1,3/4-岩藻糖基转移酶fuct14的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述β-1,3-半乳糖基转移酶wbgo的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述α1,3-岩藻糖转移酶的氨基酸序列的ncbi登录号为aab93985.1、mbo5664686.1或aab81031.1，或所述α1,3-岩藻糖转移酶的氨基酸序列如seq id no.12所示。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，以质粒prsfduet-1为载体表达所述甘露糖1-鸟苷酸转移酶manc，磷酸甘露糖酶manb、gdp-d-甘露糖-4,6-脱水酶gmd和gdp-岩藻糖合成酶wcag；以质粒pcdfduet 1为载体表达所述β-1,3-半乳糖基转移酶wbgo和α1,3-岩藻糖转移酶；以质粒petduet-1为载体表达所述α1,3/4-岩藻糖基转移酶fuct14。
4.一种生产乳...
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