【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物，具体涉及一种同时高产蛹虫草子实体和虫草素的培养方法。
技术介绍
1、蛹虫草(cordyceps militaris)又名北冬虫夏草，属于子囊菌纲、肉座菌目、麦角菌科虫草属。虫草素是虫草中主要的活性成分之一。虫草素具有多种生物学活性，如抗肿瘤、抗增殖、抗转移、抗菌、抗病毒、免疫调节和抗炎等。目前虫草素的生物制法主要有两种：一是固体发酵获得虫草子实体，再从中提取；二是通过虫草液体发酵，从发酵液中直接提取。由于液体发酵比固体发酵在发酵规模、菌体生长速率、生长密度以及可控性上的优势，虫草液体发酵提取虫草素成为主要的虫草素制备方法。目前虫草素菌株大规模生产主要采用深层发酵培养和表层静止发酵培养箱结合的发酵方法，但是仍然存在虫草素菌株退化、产量波动和不稳定等因素，菌株出草等限制性因素，导致虫草素在大规模生产过程中出现诸多问题。
2、目前报道的蛹虫草高产菌株的选育方法很多，其中有专利cn104885931a报道的一种n+离子束注入诱变选育蛹虫草菌株的方法及所育的一株生长速度快、菌丝体产量高且高产虫草素的蛹虫草菌株。已知真菌的交配型系统分为同宗配合和异宗配合2大类，其中真菌的交配型是控制其交配亲和性和有性生殖的遗传基础，与蛹虫草的菌种退化有着极大关联。专利cn111527987a报道了一种两步接种，通过控制异核交配型基因，提高蛹虫草子实体产量的方法。
3、目前报道的蛹虫草出草方式，大部分以固体出草为主，其中专利cn103283480a报道的液体出草方法，主要通过调整液体培养基配方及液体的粘稠度，调整
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是基于现存的研究基础和技术方案，提供一种既能高产虫草素又能出蛹虫草子实体的培养方法。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
3、一种同时高产蛹虫草子实体和虫草素的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
4、(1)菌种活化与转色：将蛹虫草菌株活化、培养后进行菌株转色；
5、(2)孢子悬液的制备：将步骤(1)转色好的菌株接入种子液培养获得菌丝体悬液，再将菌丝体悬液振荡、过滤收集孢子悬液；
6、(3)单配型菌株的筛选与培养：将步骤(2)制备好的孢子悬液梯度稀释涂布于筛选培养基上，筛选得到不同表型的孢子，再将不同表型的孢子的种子液接种于发酵培养基中进行产量验证，获得对应的多株单配型菌株；
7、(4)交配型菌株的复配与培养：将步骤(3)获得的单配型菌株的种子液任意几种组合同时接种于发酵培养基进行发酵培养获得同时产蛹虫草子实体和虫草素的交配型菌株。
8、其中，所述的虫草素包括液体虫草素和固体虫草素；具体的，所述的固体虫草素来源于蛹虫草子实体及菌皮。
9、其中，步骤(1)中，所述的蛹虫草菌株为蛹虫草cordyceps militaris，菌株号cy1909，已于2019年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.18581。该菌株详细的信息已公开在专利cn111117896b中。
10、其中，步骤(1)中，所述的活化，具体为：将菌株cy1909甘油管冻存状态，活化至pda平板培养基上。其中，所述的pda平板培养基配方为：土豆汁200g/l、葡萄糖20g/l、磷酸二氢钾3g/l、硫酸镁1.5g/l、vb1 0.1g/l。
11、其中，步骤(1)中，所述的培养，其条件为：20～26℃恒温黑暗培养6～7d至菌丝长满平板。优选的，26℃恒温黑暗培养6～7d至菌丝长满平板。
12、其中，步骤(1)中，所述的菌株转色，其条件为：温度20～26℃，光照强度200～500lx。优选的，温度26℃，光照强度200～500lx。
13、其中，步骤(2)中，所述的种子培养基，其配方为：葡萄糖35～42g/l、酵母粉9～12g/l、蛋白胨17～20g/l、磷酸二氢钾0.1～0.5g/l、磷酸氢二钾0.1～0.5g/l、ph 5.8～6.5；优选的，所述的种子培养基，其配方为：葡萄糖42g/l、酵母粉9g/l、蛋白胨17g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、磷酸氢二钾0.5g/l、ph 5.8。
14、其中，步骤(2)中，所述的培养，其条件为：20～26℃、100～180rpm、培养3～4d。优选的，26℃、100～180rpm、培养64～72h。
15、其中，步骤(2)中，所述的菌丝体种子液振荡、过滤收集孢子悬液，具体是向装有菌丝体种子液的三角瓶中加入10～20颗灭菌的玻璃珠，充分震荡，将孢子充分分散释放；然后经2～3层纱布，过滤，去除过大的菌丝体，收集得到孢子悬液。
16、其中，步骤(3)中，所述的筛选培养基，其配方为：葡萄糖35～42g/l，蛋白胨17～20g/l，酵母粉9～12g/l，磷酸二氢钾0.1～0.5g/l，磷酸氢二钾0.1～0.5g/l，硫酸镁0.1～0.5g/l，腺嘌呤1～4g/l，1％ btb溶液0.4ml/l，ph5.8～6.5；优选的，所述的筛选培养基，其配方为：葡萄糖42g/l，蛋白胨17g/l，酵母粉9g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，硫酸镁0.5g/l，腺嘌呤4g/l，1％ btb溶液0.4ml/l，ph5.8。
17、其中，步骤(3)中，所述的多株单配型菌株为2～10株单配型菌株。具体的，在本专利技术的一些实施例中，共分筛出的8株单孢子菌株，并以透明圈大小为筛选依据，筛选出透明圈较大的单配型菌株，即d15、d19、d21、d24菌株。
18、其中，步骤(3)中，所述的产量验证以子实体(包括菌皮)干重，液体虫草素浓度、固体子实体(包括菌皮)虫草素含量等为指标进行产量验证。
19、其中，步骤(3)和步骤(4)中，所述的接种，其接种量为5～15％v/v，优选10％v/v。
20、其中，步骤(3)和步骤(4)中，所述的发酵培养，其发酵培养基基为：葡萄糖35～42g/l、酵母粉9～12g/l、蛋白胨17～20g/l、磷酸二氢钾0.1～0.5g/l、磷酸氢二钾0.1～0.5g/l、腺嘌呤1～4g/l、ph 5.8～6.5；所述的发酵培养，其发酵条件为：20～26℃、黑暗、静置7～10d后进行光照管理。优选的，所述的发酵培养，其发酵培养基基为：葡萄糖42g/l、酵母粉9g/l、蛋白胨17g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、磷酸氢二钾0.5g/l、腺嘌呤4g/l、ph 5.8；所述的发酵培养，其发酵条件为：26℃、黑暗、静置7～10d后进行光照管理。
21、具体的，所述的光照管理分为原基分化阶段和子实体生长阶段；其中，所述的原基分化阶段光照时间不低于8h，温差10～15℃，培养5～10d，具体的培养条件为：8:00～本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时高产蛹虫草子实体和虫草素的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的虫草素包括液体虫草素和固体虫草素；其中，所述的固体虫草素来源于蛹虫草子实体及菌皮。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的蛹虫草菌株为蛹虫草Cordyceps militaris，菌株号CY1909，已于2019年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18581。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的培养，其条件为：20～26℃恒温黑暗培养6～7d；所述的菌株转色，其条件为：温度20～26℃，光照强度200～500lx。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的种子培养基，其配方为：葡萄糖35～42g/L、酵母粉9～12g/L、蛋白胨17～20g/L、磷酸二氢钾0.1～0.5g/L、磷酸氢二钾0.1～0.5g/L、pH 5.8～6.5；所述的培养，其条件为：20～26℃、10
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的筛选培养基，其配方为：葡萄糖35～42g/L，蛋白胨17～20g/L，酵母粉9～12g/L，磷酸二氢钾0.1～0.5g/L，磷酸氢二钾0.1～0.5g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，腺嘌呤1～4g/L，1％BTB溶液0.4mL/L，pH5.8。
7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中，所述的接种，其接种量为5～15％v/v。
8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中，所述的发酵培养，其发酵培养基基为：葡萄糖35～42g/L、酵母粉9～12g/L、蛋白胨17～20g/L、磷酸二氢钾0.1～0.5g/L、磷酸氢二钾0.1～0.5g/L、腺嘌呤1～4g/L、pH 5.8；所述的发酵培养，其发酵条件为：20～26℃、黑暗、静置7～10d后进行光照管理。
9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述的光照管理分为原基分化阶段和子实体生长阶段。
10.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述的原基分化阶段，其光照时间不低于8h，温差10～15℃，培养5～10d；所述的子实体生长阶段，其温度18～22℃，湿度85～95％，保持16h光照，培养22～26d。
...【技术特征摘要】
1.一种同时高产蛹虫草子实体和虫草素的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的虫草素包括液体虫草素和固体虫草素；其中，所述的固体虫草素来源于蛹虫草子实体及菌皮。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的蛹虫草菌株为蛹虫草cordyceps militaris，菌株号cy1909，已于2019年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.18581。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的培养，其条件为：20～26℃恒温黑暗培养6～7d；所述的菌株转色，其条件为：温度20～26℃，光照强度200～500lx。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的种子培养基，其配方为：葡萄糖35～42g/l、酵母粉9～12g/l、蛋白胨17～20g/l、磷酸二氢钾0.1～0.5g/l、磷酸氢二钾0.1～0.5g/l、ph 5.8～6.5；所述的培养，其条件为：20～26℃、100～180rpm、培养3～4h。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(3...
【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，魏荷芬，陈勇，刘庆国，温庆仕，唐成伦，汤德朋，马祥敏，
申请(专利权)人：南京高新工大生物技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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