【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑，尤其涉及一种基于crispr/cas9技术构建猪hnf1b基因敲除细胞系的方法。
技术介绍
1、肝细胞核因子1b(hepatocyte nuclear factor 1-beta,hnf1b)是一种在脊椎动物体内拥有高度保守结构和功能的转录因子，猪hnf1b基因位于12号染色体，由9个外显子编码，在肾脏、肝脏、胰腺及生殖器官等多种组织中表达，其参与多个重要脏器的发育，包括肝脏、肾脏、胰腺、脑等，并在维持脏器正常功能中发挥重要作用。目前hnf1b功能研究聚焦于人类，hnf1b基因容易发生各种突变，引起多种疾病的发生和发展。
2、现有技术中尚未见到与猪hnf1b基因相关的hnf1b基因敲除细胞系构建技术方案。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于crispr/cas9技术构建猪hnf1b基因敲除细胞系的方法，为猪抗病育种提供了新的途径。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种靶向敲除猪hnf1b基因的sgrna，包括两条单链寡核苷酸序列：sgrna-hnf1b-f和sgrna-hnf1b-r；
4、所述sgrna-hnf1b-f的核苷酸序列如seq id no.1所示；
5、所述sgrna-hnf1b-r的核苷酸序列如seq id no.2所示。
6、本专利技术还提供了包含上述sgrna的重组载体。
7、优选的，以pkl
8、本专利技术还提供了上述sgrna或上述重组载体在对猪基因组中的hnf1b基因进行基因编辑中的应用。
9、优选的，所述基因编辑的方法包括crispr/cas9。
10、本专利技术还提供了上述sgrna或上述重组载体在构建猪hnf1b基因敲除细胞系中的应用。
11、本专利技术还提供了一种基于crispr/cas9技术构建猪hnf1b基因敲除细胞系的方法，包括以下步骤：
12、s1、对sgrna-hnf1b-f和sgrna-hnf1b-r进行退火、酶切后连接至线性化的pklv2-u6grna5(ggfp)-pgkbfp2agfp-w载体，构建得到重组载体；
13、s2、将所述重组载体与慢病毒包装质粒混合，共转染hek293t细胞，得到包装慢病毒；
14、s3、将所述包装慢病毒浓缩后感染稳定表达cas9细胞的初始细胞，挑取单克隆细胞，扩大培养得到单克隆细胞系；
15、s4、将所述单克隆细胞系进行筛选、验证，得到猪hnf1b基因敲除细胞系。
16、优选的，所述慢病毒包装质粒包括pspxa2和/或pmd2.g；
17、所述初始细胞为pk-15细胞。
18、本专利技术还提供了通过上述方法构建得到的猪hnf1b基因敲除细胞系。
19、本专利技术还提供了上述猪hnf1b基因敲除细胞系在猪抗病育种中的应用。
20、本专利技术的有益效果：
21、本专利技术采用crispr/cas9技术，成功敲除了pk-15细胞中的hnf1b基因，建立hnf1b基因敲除的pk-15细胞系，该细胞系遗传稳定，细胞形态、增殖均与对照组细胞无明显差异，且可用于研究hnf1b基因在抵抗黄曲霉毒素b1感染中的功能验证，揭示hnf1b基因在抵抗黄曲霉毒素b1感染中的作用机制。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种靶向敲除猪HNF1B基因的sgRNA，其特征在于，包括两条单链寡核苷酸序列：sgRNA-HNF1B-F和sgRNA-HNF1B-R；
2.包含权利要求1所述sgRNA的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，以pKLV2-U6gRNA5(gGFP)-PGKBFP2AGFP-W载体为初始载体。
4.权利要求1所述的sgRNA或权利要求2或3所述的重组载体在对猪基因组中的HNF1B基因进行基因编辑中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因编辑的方法包括CRISPR/Cas9。
6.权利要求1所述的sgRNA或权利要求2或3所述的重组载体在构建猪HNF1B基因敲除细胞系中的应用。
7.一种基于CRISPR/Cas9技术构建猪HNF1B基因敲除细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述慢病毒包装质粒包括PSPXA2和/或PMD2.G；
9.通过权利要求7或权利要求8所述的方法构建得到的猪HNF1B基因敲
10.权利要求9所述的猪HNF1B基因敲除细胞系在猪抗病育种中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种靶向敲除猪hnf1b基因的sgrna，其特征在于，包括两条单链寡核苷酸序列：sgrna-hnf1b-f和sgrna-hnf1b-r；
2.包含权利要求1所述sgrna的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，以pklv2-u6grna5(ggfp)-pgkbfp2agfp-w载体为初始载体。
4.权利要求1所述的sgrna或权利要求2或3所述的重组载体在对猪基因组中的hnf1b基因进行基因编辑中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因编辑的方法包...
【专利技术属性】
技术研发人员：李聪聪，杨丽玉，牛丽珠，徐秋良，姜东凤，牛晖，刘梦，刘佳欣，张金福，谢胜松，
申请(专利权)人：河南牧业经济学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。