基于CRISPR-Cas9系统的tmexCD-toprJ耐药基因消除方法技术方案

本发明专利技术公开了一种spacer基因片段，所述spacer基因片段的序列为SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还公开了表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株及其在tmexCD‑toprJ耐药基因的消除中的应用。本发明专利技术最后还公开了基于CRISPR‑Cas9系统的tmexCD‑toprJ耐药基因消除方法。本发明专利技术通过构建了CRISPR‑Cas9系统，其能够靶向清除临床菌株中的tmexCD‑toprJ基因簇，从而恢复细菌对替加环素敏感性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于变异或遗传工程，涉及基于crispr-cas9系统的tmexcd-toprj耐药基因消除方法，尤其涉及基于crispr/cas9系统的消除耐药基因tmexcd-toprj介导的细菌替加环素耐药的方法。

技术介绍

1、抗生素的应用在临床疾病的治疗中发挥重大的作用。然而，在过去的几十年里，广谱抗生素在医药和畜牧业中的过度使用甚至滥用，导致了细菌的快速进化和细菌耐药性的出现。近年来，广谱耐药的革兰氏阴性菌的流行迅速增加，降低了碳青霉烯类抗生素的疗效，其治疗方案主要依赖粘菌素和替加环素。近年来，我国科学家发现了rnd(resistancenodulation division)外排泵家族的tmexcd-toprj基因簇，其能降低包括替加环素、奥玛环素、伊拉环素等在内的所有四环素类抗生素的敏感性，还能介导头孢菌素类、氨基糖苷类、喹诺酮类等多种抗菌药物耐药。其在临床病原菌中，尤其是在肺炎克雷伯菌及其相近菌属中的流行，严重的削弱了替加环素在临床中的药物疗效。关于如何对抗该耐药基因引起的替加环素耐药仍然有待研究。

2、crispr(cluster本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种spacer基因片段，其特征在于，所述spacer基因片段的序列如SEQ ID NO.:2所示。

2.表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株，其特征在于，其含有权利要求1所述的spacer基因片段。

3.一种pCas9Kill-T质粒，其特征在于，所述pCas9Kill-T质粒序列如SEQ ID NO.:1所示。

4.权利要求3所述的pCas9Kill-T质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的pCas9Kill-T质粒的构建方法，其特征在于，所述DNA片段1的序列如SEQ ID NO.:19所示，所述DN...

【技术特征摘要】

1.一种spacer基因片段，其特征在于，所述spacer基因片段的序列如seq id no.:2所示。

2.表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌株，其特征在于，其含有权利要求1所述的spacer基因片段。

3.一种pcas9kill-t质粒，其特征在于，所述pcas9kill-t质粒序列如seq id no.:1所示。

4.权利要求3所述的pcas9kill-t质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的pcas9kill-t质粒的构建方法，其特征在于，所述dna片段1的序列如seq id no.:19所示，所述dna片段2序列如seq id no.:20所示，所述dna片段3序列如seq id no.:21所示，所述dna片段4序列如seq id no.:22所示。

6.根据权利要求4所述的pcas9kill-t质粒的构建方法，其特征在于，步骤4）中的具体步骤如下：针对tmexcd-toprj基因簇中的tmexc基因的不同变体tmexc1、tmexc2、tmexc3的保守区域设计通用的spacer...

【专利技术属性】
技术研发人员：李瑞超，王志强，徐磊，刘源，肖霞，王勉之，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：