【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于高通量测序的gii组诺如病毒全基因组扩增富集的引物组、试剂盒及其应用，属于生物。
技术介绍
1、诺如病毒(norovirus,nov)是引起急性肠胃炎散发和暴发的重要病原体，通过粪口途径在人与人之间传播，感染后可出现严重的腹泻和呕吐症状。诺如病毒每年在全世界造成大约20万人死亡，其中发展中国家的儿童将近7万多例，造成了巨大的经济负担和社会负担。
2、全基因组测序(whole genome sequencing,wgs)数据可详细阐明系统进化关系，监测病原体的传播和进化，其越来越多地被用于与病原体相关的疫情溯源调查。对于诺如病毒来说，全基因组测序能够成功区分各种诺如病毒基因型别，并可在暴发后进行回顾性分析，以确认病毒各基因进化速率，并通过鉴定特异性的突变来预测新变异株的流行和传播。
3、传统的诺如病毒全基因组测序主要有两种方式，一种是宏基因组测序，无需pcr扩增，但对标本病毒载量要求较高，且费用昂贵，一般用于未知病原体的检测。另一种是通过设计特异性叠瓦式引物对，通过rt-pcr扩增多个片段，纯化后进行测序，最后将多个测序结果拼接为一个完整的诺如病毒基因组。最初利用一代测序对叠瓦式扩增产物进行测序，该方法试剂耗材成本低廉，但是叠瓦式扩增的片段较短，常见的扩增范围是1000-2500个核苷酸(nucleotide,nt)，因为一代测序的每次读长约为1000nt左右，过长的片段需要分为多个测序反应，使得测序时间延长数倍。此外，一代测序通量低，测序数量有限，且每个标本仅能得到一条序列，不同标本
4、诺如病毒基因组全长约为7500nt左右，其全基因组扩增一直是高通量测序中的难点，因为其不同型别间的核苷酸一致性较低，同一型别随时间的变异速度较快，因此目前的研究都是针对某一型别进行全基因组扩增。如专利申请号为“201610510474.x”，“201810646156.5”及“201810646146.1”的中国专利申请，其所扩增的均为单一基因型别的gii组诺如病毒，且存在多个引物组。2013年的博士论文“诺如病毒gⅱ型流行株基因组特征分析及进化机制研究”中，作者利用自行设计的三条引物加上文献中的引物对gii组诺如病毒进行扩增，仅扩增出三个全长基因组，并且其中两个为同一型别，说明灵敏度十分有限。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于高通量测序的gii组诺如病毒全基因组扩增富集的引物组、试剂盒及其应用。
2、本专利技术的专利技术人设计了一种用于高通量测序的gii组诺如病毒全基因组扩增富集的引物组，可同时扩增几乎所有的gii组诺如病毒的基因型别。本专利技术的引物组包括第1管引物组和第2管引物组，合计13条引物，除第2管的一条反向引物(gii-2r)，其余所有12条扩增引物均是专利技术人自行设计的，引物的起始位点如下表所示。其中第1管包含3条引物，扩增片段大小约5030nt，第2管包含10条引物，扩增片段大小约4700nt～5100nt，两个扩增片段拼接之后即为全长的诺如病毒基因组，两个扩增片段之间有约2200nt～2600nt的交叠区。本专利技术的引物组可同时扩增几乎所有的gii组诺如病毒的基因型，前期实验中已成功扩增常见的10个基因型别。此外，引物组合并为两管，操作简单，试剂为通用扩增试剂，整体造价经济低廉。
3、本专利技术解决技术问题的技术方案具体如下：
4、在本专利技术的第一方面，提供了用于高通量测序的gii组诺如病毒全基因组扩增富集的引物组，包括独立包装的第1管引物组和第2管引物组，其核苷酸序列分别如下表所示：
5、
6、
7、其中，
8、第1管引物组包括2条上游引物，其中t-gii-1f-1为除gii.p15型外的所有gii组诺如病毒的特异性扩增引物，t-gii-1f-2为gii.p15型诺如病毒的特异性扩增引物，1条下游引物t-gii-1r为gii组诺如病毒的特异性扩增引物。
9、所述第2管引物组包括9条上游引物，其中t-sc1-6开头的引物为gii组诺如病毒6个系统发育分支各自的特异性扩增引物，1条下游引物gii-2r为gii组诺如病毒的特异性扩增引物。
10、绝大部分引物3’端末位为碱基t，这使得错配的引发效率大大降低，无法选择t时，选择g为末位碱基。此外，引物5’端首位和3’端末位均为g或t碱基，避免了引物间的互补结合，以及过多引物二聚体的形成。
11、在本专利技术的第二方面，提供了用于高通量测序的gii组诺如病毒全基因组扩增富集的rt-pcr试剂盒，包括如第一方面所述的用于高通量测序的gii组诺如病毒全基因组扩增富集的引物组。
12、进一步地，所述的试剂盒还包括rt-pcr试剂，可以是市场通用的rt-pcr试剂，如南京诺唯赞生产的one step rt-pcrkit试剂。
13、在本专利技术的第三方面，提供了如第一方面所述的用于高通量测序的gii组诺如病毒全基因组扩增富集的引物组或如第二方面所述的试剂盒在gii组诺如病毒全基因组扩增富集中的应用，扩增富集产物可以用于高通量测序。
14、进一步地，应用时，利用rt-pcr试剂加上引物组工作液，所述的引物组的引物工作液的制备方法，包括如下步骤：
15、1)将第1管引物组引物的合成干粉加无rna酶水配制成20微摩尔/升的工作浓度，加水体积为每od浓度值的5倍；第1管的3条引物均分别配制为20微摩尔/升，然后等体积混合；
16、2)将第2管引物组引物的合成干粉加无rna酶水配制成66.7微摩尔/升的工作浓度，加水体积为每od浓度值的1.5倍；同第1管一样，第2管的10条引物都分别配制为66.7微摩尔/升，然后等体积混合；
17、3)将两管引物组引物分别按照体积比为1:1的比例配置成引物混合液。
18、在本专利技术的第四方面，提供了应用如第一方面所述的用于高通量测序的gii组诺如病毒全基因组扩增富集的引物组或如第二方面所述的试剂盒进行非疾病诊断目的的gii组诺如病毒全基因组扩增富集的方法。所述的方法为利用通用的反转录聚合酶链式反应(rt-pcr)试剂加上本专利技术的两管引物组工作液即可上机扩增富集gii组诺如病毒的全长基因组。此方法用于非疾病诊断目的，主要用于病毒的进化分析及暴发疫情中的溯源。
19、进一步地，所述的引物组工作液的制备方法，包括如下步骤：
20、1)将第1管引物组引物的合成干粉加无rna酶水配制成20微摩尔/升的工作浓度，加水体积为每od浓度值的5倍；第1管的3条引物均分别配制为20微摩尔/升，然后等本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于高通量测序的GII组诺如病毒全基因组扩增富集的引物组，其特征在于，包括第1管引物组和第2管引物组，核苷酸序列分别如下表所示：
2.用于高通量测序的GII组诺如病毒全基因组扩增富集的RT-PCR试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的用于高通量测序的GII组诺如病毒全基因组扩增富集的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括RT-PCR试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的RT-PCR试剂为诺唯赞的One StepRT-PCRKit试剂。
5.如权利要求1所述的用于高通量测序的GII组诺如病毒全基因组扩增富集的引物组或如权利要求2所述的试剂盒在GII组诺如病毒全基因组扩增富集中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，应用时利用RT-PCR试剂加上引物组工作液，所述的引物组的引物工作液的制备方法，包括如下步骤：
7.应用如权利要求1所述的用于高通量测序的GII组诺如病毒全基因组扩增富集的引物组或如权利要求2所述的试剂盒进行非疾病诊断目的的GII组诺如病毒
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的引物组的引物工作液的制备方法，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.用于高通量测序的gii组诺如病毒全基因组扩增富集的引物组，其特征在于，包括第1管引物组和第2管引物组，核苷酸序列分别如下表所示：
2.用于高通量测序的gii组诺如病毒全基因组扩增富集的rt-pcr试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的用于高通量测序的gii组诺如病毒全基因组扩增富集的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括rt-pcr试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的rt-pcr试剂为诺唯赞的one steprt-pcrkit试剂。
5.如权利要求1所述的用于高通量测序的gii组诺如病毒全基因组扩增富集的引物组...
【专利技术属性】
技术研发人员：付建光，李楚楚，秦圆方，艾静，邓斐，樊欢，王慎骄，余慧燕，鲍倡俊，朱立国，
申请(专利权)人：江苏省疾病预防控制中心江苏省公共卫生研究院，
类型：发明
国别省市：
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