一种利用混合碳源生产2制造技术

本发明专利技术提供了一种利用混合碳源生产2

【技术实现步骤摘要】
一种利用混合碳源生产2
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岩藻糖基乳糖的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种利用混合碳源生产2
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岩藻糖基乳糖的方法及其应用，属于微生物代谢工程和食品发酵


技术介绍

[0002]人乳寡糖(Human milk oligosaccharides，HMOs)是人乳中仅次于脂肪和乳糖的第三大固体成分，在牛乳及其他哺乳动物乳液中含量极低。其主要分为中性岩藻糖基(neutral fucosylated)、中性非岩藻糖基(neutral non
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fucosylated)、唾液酸(sialylated)和其他HMOs，包括但不限于2
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岩藻糖基乳糖(2
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FL)、乳酰
‑
N
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岩藻戊糖I(LNFP I)、3
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岩藻糖基乳糖(3
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FL)、乳酰
‑
N
‑
新四糖(LNnT)、乳酰
‑
N
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四糖(LNT)和6
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唾液酸乳糖(6
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SL)。其中，2
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岩藻糖基乳糖在人乳中含量最为丰富，约占总HMOs的30％。2
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岩藻糖基乳糖具有调节肠道菌群、抵抗病原菌的黏附、促进神经系统发育和修复以及增强免疫调节水平等生理活性。
[0003]目前生产2
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岩藻糖基乳糖主要有化学合成法、全细胞合成法和酶法合成三种。但是，上述方法均存在弊端：化学合成法步骤冗长、反应条件苛刻、得率低，还需要用到大量有机试剂等问题；全细胞合成法专一性好，但反应底物需使用岩藻糖作为岩藻糖基供体，成本较高；酶法合成同全细胞合成一样，缺乏成本较低的岩藻糖基供体，同时反应效率和产量低。鉴于以上情况，利用微生物发酵法合成2
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岩藻糖基乳糖成为研究的热点。大肠杆菌由于具有遗传背景清晰、操作简单、表达稳定等特点，已经成为了一种研究产业化工程菌的理想模式生物。目前，现有技术披露了大肠杆菌全细胞催化生产2
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岩藻糖基乳糖的两条途径，分别是：从头合成途径和补救途径，其中从头合成途径需要磷酸甘露糖变位酶(ManB)、甘露糖
‑1‑
磷酸鸟嘌呤基转移酶(ManC)、GDP
‑
甘露糖
‑6‑
脱氢酶(Gmd)、GDP
‑
岩藻糖合成酶(WcaG)系列酶催化合成2
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岩藻糖基乳糖前体GDP
‑
岩藻糖，GDP
‑
岩藻糖在α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶(FucT2)的作用下，将岩藻糖基团转移至乳糖，合成2
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岩藻糖基乳糖。现有技术中2
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岩藻糖基乳糖的全细胞催化生产除了对上述酶进行过表达外，还对乳糖通透酶LacY进行了过表达以增加乳糖进胞，并且对GDP
‑
岩藻糖合酶和乳糖的代谢旁路UDP
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葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ和β
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半乳糖苷酶基因lacZ进行了敲除。但是，现有技术中大多利用单一碳源如：葡萄糖、甘油，或者混合碳源如：葡萄糖/岩藻糖混合碳源、甘油/岩藻糖混合碳源进行生产2
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岩藻糖基乳糖。

技术实现思路

[0004][技术问题][0005]本专利技术要解决的技术问题是现有菌株无法同时利用甘油和葡萄糖为碳源高效生产2
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岩藻糖基乳糖的问题。
[0006][技术方案][0007]为满足2
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岩藻糖基乳糖工业化需求，本专利技术提供了一种利用合成生物学手段改
造大肠杆菌的方法，敲除了2
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岩藻糖基乳糖合成途径中的旁路基因，强化了关键酶的表达，同时改造了PTS系统，使大肠杆菌能同时利用葡萄糖和甘油，高效生产2
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岩藻糖基乳糖。
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种葡萄糖和甘油作为混合碳源进行发酵生产2
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岩藻糖基乳糖的方法，所述方法主要包括以下步骤：
[0009](1)提供一种重组菌株，该重组菌株能够以乳糖为底物，以葡萄糖和/或甘油为碳源，合成2
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岩藻糖基乳糖；
[0010](2)以步骤(1)的菌株作为表达菌株，以葡萄糖和甘油作为混合碳源进行发酵生产2
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岩藻糖基乳糖。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，对重组菌株的β
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半乳糖苷酶基因lacZ、UDP
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葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ和PTS系统中负责编码合成葡萄糖转运及磷酸化载体蛋白的基因ptsG进行了基因敲除。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，将磷酸甘露糖变位酶ManB基因、甘露糖
‑1‑
磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC基因、GDP
‑
甘露糖
‑6‑
脱氢酶Gmd基因、GDP
‑
岩藻糖合成酶WcaG基因、α
‑
1,2岩藻糖基转移酶FucT2基因和乳糖通透酶LacY基因分别构建至质粒上，转化至重组菌株中进行过表达。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述β
‑
半乳糖苷酶的登录号为：QZI62628.1；所述UDP
‑
葡萄糖脂质载体转移酶的登录号为：QZI62770.1；所述编码合成葡萄糖转运及磷酸化载体蛋白的登录号为：CAQ31622.1。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述磷酸甘露糖变位酶ManB的登录号为：QZI63054.1；所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC的登录号为：ACT43784.1；所述GDP
‑
甘露糖
‑6‑
脱氢酶Gmd的登录号为：QZI62765.1；所述GDP
‑
岩藻糖合成酶WcaG的登录号为：QZI62766.1；所述α
‑
1,2岩藻糖基转移酶FucT2的登录号为：AAC99764.1；所述乳糖通透酶LacY的登录号为：CAQ30818.2。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述过表达是将磷酸甘露糖变位酶基因manB，甘露糖
‑1‑
磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC以及GDP
‑
甘露糖
‑6‑
脱氢酶基因gmd，GDP
‑
岩藻糖合成酶基因wcaG连接至质粒pRSFDuet
‑
1上后，转化至基因敲除过的重组菌株中。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述过表达是将岩藻糖基转移酶基因fucT2和乳糖通透酶基因l本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用混合碳源生产2
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岩藻糖基乳糖的方法，包括以下步骤：(1)提供一种重组菌株，该重组菌株能够以乳糖为底物，以葡萄糖和/或甘油为碳源，合成2
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岩藻糖基乳糖；(2)以步骤(1)的菌株作为生产菌株，以混合碳源进行发酵生产2
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岩藻糖基乳糖；所述混合碳源为葡萄糖和甘油。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合碳源中，以重量比计，葡萄糖：甘油的比例为1：(0.0625
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16)。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生产过程中还流加了底物乳糖。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述乳糖终浓度为2
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8g/L。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组菌株包括大肠杆菌BL21(DE3)。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌敲除了乳糖通透酶基因lacZ、UDP

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩峰，曹嘉誉，陈永丽，潘朝智，顾丽红，
申请(专利权)人：深圳中科欣扬生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：