一种生产无降解类人源胶原蛋白的毕赤酵母及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种生产无降解类人源胶原蛋白的毕赤酵母及其应用，属于生物工程领域。本发明专利技术对类人源胶原蛋白基因进行了计算机优化改造，获得了可在微生物发酵过程中不发生降解的类人源胶原蛋白，并使用了分泌信号α

【技术实现步骤摘要】
一种生产无降解类人源胶原蛋白的毕赤酵母及其应用


[0001]本专利技术涉及一种生产无降解类人源胶原蛋白的毕赤酵母及其应用，属于生物工程领域。

技术介绍

[0002]美国食品药品监督管理局(Food Drug Administration，FDA)认定毕赤酵母是一般公认安全的(generally regarded as safe，GRAS)微生物，在医药和食品领域有广泛的应用。毕赤酵母表达系统具有杂蛋白分泌较少、培养成本低廉、发酵工艺成熟等优点，已有多种外源蛋白在该系统中成功表达，包括已报道的表皮增强因子(Epidermal augmentum factor，EGF)、人血清蛋白(Human serum albumin，HSA)、乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)、胶原蛋白等；其中，医药制备领域比如疫苗、胰岛素产品、酶的替代品和细胞因子等；在食品工业和生物材料中的应用，比如纤维素酶、β
‑
甘露聚糖酶、半纤维素酶等。
[0003]胶原蛋白是机体中含量最丰富的功能性结构蛋白，广泛存在于人和动物的皮肤、肌腱、血管等结缔组织的细胞外基质中，占机体蛋白质总量的30％左右。近年来随着材料科学以及组织工程的兴起与发展，胶原蛋白作为机体自然蛋白，由于其生物相容性好，抗原性弱，对皮肤亲和力高，生物降解性可控等，在生物医药、食品和日化等领域备受青睐。
[0004]微生物细胞相比人细胞在蛋白翻译后修饰方面存在明显的劣势，仅能实现简单的糖基化、甲基化、乙酰化等修饰，制备的重组蛋白无法形成更高级的胶束、胶管结构，多以线状、α
‑
螺旋、β
‑
折叠等低级结构存在，不能像天然胶原那样形成稳定且复杂的空间结构，在生产、储存过程中容易出现降解、局部聚集现象，增加了纯化和储存的难度。目前利用微生物合成具有三维立体结构的胶原蛋白难度较高，随着类人源胶原蛋白的市场需求不断扩大，合成稳定不降解的类人源胶原蛋白对扩大其应用场景具有重要的商业价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术利用基因工程手段使在毕赤酵母中制备了无降解类人源胶原蛋白。该类人源胶原蛋白基因来源于人III型胶原蛋白，于毕赤酵母GS115中表达。
[0006]本专利技术提供了一种类人源胶原蛋白，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
[0007]本专利技术还提供了编码所述类人源胶原蛋白的基因。
[0008]在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]本专利技术还提供了编码所述类人源胶原蛋白的基因工程菌。
[0010]在一种实施方式中，所述基因工程菌以pPIC9K或pPICZαA质粒为表达载体，表达所述类人源胶原蛋白。
[0011]在一种实施方式中，所述类人源胶原蛋白通过α
‑
factor强化分泌表达。
[0012]在一种实施方式中，所述基因工程菌以毕赤酵母GS115为宿主。
[0013]本专利技术还提供了制备所述类人源胶原蛋白的方法，所述方法是将所述基因工程菌
YNB、(4
×
10
‑5)％Biotin、10g/L甘油。
[0035]BMMY：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L、13.4g/L YNB、(4
×
10
‑5)％Biotin。
[0036]BSM基础盐培养基：26.7ml/L 85％H3PO4、0.93g/L CaSO4、18.2g/L K2SO4、14.9g/L MgSO4·
7H2O、4.13g/L KOH、40g/L甘油、8.0ml/LPMT1。
[0037]PMT1：6.0g/L CuSO4·
5H2O、0.08g/L NaI、3.0g/L MnSO4·
H2O、0.2g/L Na2MoO4·
2H2O、0.02g/L H3BO3、0.5g/L CoCl2、20.0g/L ZnCl2、65.0g/L FeSO4·
7H2O、0.2g/L Biotin、5.0ml浓H2SO4。
[0038]表1质粒构建引物表
[0039][0040][0041]蛋白表达量的测定方法：使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司)检测目的蛋白浓度。具体操作步骤如下：首先配制蛋白标准品和BCA工作液，蛋白浓度测定时，将不同浓度(0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml)的20μL蛋白标准品加到酶标板中，再向其中加入200μL BCA工作液，37℃放置20
‑
30分钟充分反应，用酶标仪测定A562波长下的吸光度，并绘制出标准曲线。蛋白样品浓度检测时，先稀释到合适的浓度，反应体系仍然为20μL蛋白样品加200μL BCA工作液，37℃放置20
‑
30分钟，用酶标仪测定A562波长下的吸光度，后根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
[0042]实施例1：类人源胶原蛋白表达菌株的构建
[0043](1)表达质粒的设计和构建
[0044]利用毕赤酵母表达类人源胶原蛋白的优势是可以将蛋白分泌在细胞外，减少细胞压力，降低生产成本。但是，在发酵过程中面临一个很严重的问题是蛋白降解，这是因为毕赤酵母自身在发酵过程中会分泌蛋白酶，可能会降解类人源胶原蛋白。为了减少蛋白的降解和提高蛋白产量，利用计算机智能计算工具辅助分析了人III型胶原蛋白序列，避免了常
见的蛋白酶(Kex2等)酶切序列，同时对疏水氨基酸比例进行优化，增加合成后蛋白的可溶解性，进而提高蛋白的合成产量。
[0045]设计优化并人工合成如SEQ ID NO.1所示的目标基因序列opHScol，利用限制性内切酶EcoRI和NotI将含有AOX启动子和筛选抗性基因的载体pPIC9K和pPICZαA(购自Invitrogen公司)进行酶解并回收载体片段。再将基因片段opHScol分别与载体pPIC9K和pPICZαA进行同源重组，使目的片段准确插入到含有分泌信号α
‑
因子的分泌型载体读码框内，最终获得pPIC9K
‑
opHScol和表达pPICZαA
‑
opHScol两种重组表达载体质粒。设计的引物如表1所示。
[0046]将pPIC9K
‑
opHScol和pPICZαA
‑
opHScol质粒转化进感受态大肠杆菌DH5α或Trans T1(购自全式金公司)，其中pPIC9K
‑
opHScol在含有100mg/L氨苄霉素的LB平板筛选阳性克隆，pPICZαA
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opHScol在含有50mg/L博来霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取重组质粒进行测序鉴定(交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成)，验证正确后进行下一步高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.类人源胶原蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.编码权利要求1所述类人源胶原蛋白的基因。3.一种基因工程菌，其特征在于，表达权利要求1所述的类人源胶原蛋白。4.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，以pPIC9K或pPICZαA质粒为表达载体，表达权利要求1所述的类人源胶原蛋白基因。5.根据权利要求3或4所述的基因工程菌，其特征在于，以毕赤酵母GS115为宿主。6.一种发酵生产类人源胶原蛋白的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩峰，毛启红，陈永丽，顾丽红，潘朝智，闫志全，王琳，
申请(专利权)人：深圳中科欣扬生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：