抗逆性谷氨酰胺酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了抗逆性谷氨酰胺酶的制备方法，属于生物技术领域。本研究利用里氏木霉作为表达宿主，成功实现了隐球菌(Cryptococcus nodaensis)来源的谷氨酰胺酶的外泌表达，且产量较高。本发明专利技术基于里氏木霉异源蛋白表达系统，进行组合，通过谷氨酰胺酶基因的密码子优化，首次在里氏木霉中实现了隐球菌来源谷氨酰胺酶基因的高效分泌表达，该酶具有良好的耐盐、耐热和酸碱稳定特性，发酵液最高酶活可达4820U/L。4820U/L。4820U/L。

【技术实现步骤摘要】
抗逆性谷氨酰胺酶的制备方法


[0001]本专利技术涉及抗逆性谷氨酰胺酶的制备方法，属于生物


技术介绍

[0002]谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2，又称谷氨酰胺水解酶)催化L
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谷氨酰胺水解脱酰胺，产生L
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谷氨酸和氨。L
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谷氨酰胺酶广泛分布于动物、植物组织和微生物。因其潜在的生物技术应用和易于大规模生产的特点，微生物来源的谷氨酰胺酶基因备受关注，广泛应用于食品加工、医疗以及精细化学品如茶氨酸的生产。
[0003]L
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谷氨酸(味精)是食物中最重要的鲜味因子。在酱油发酵中，L
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谷氨酸通过两种途径产生：(1)通过蛋白酶和/或肽酶从原料蛋白中直接释放；(2)通过谷氨酰胺酶水解原料蛋白中释放的游离L
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谷氨酰胺。第二种途径对于酱油发酵过程中鲜味的增强更加重要，因为L
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谷氨酰胺能够以一种相对快速的方式通过不可逆地非酶促反应转化为焦谷氨酸盐，而焦谷氨酸盐并没有鲜味。因此，L
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谷氨酰胺酶已被广泛用于增强发酵食品的味道和香气。
[0004]谷氨酰胺的高消耗是癌细胞的特征之一。谷氨酰胺酶因其具有抗白血病的活性而被用于治疗抗淋巴细胞白血病。白血病细胞依赖于血液中的L
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谷氨酰胺作为肿瘤细胞核苷酸和蛋白质合成的前体物质，而L
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谷氨酰胺酶通过阻断前体来源，从而导致谷氨酰胺依赖性肿瘤细胞的选择性死亡。除此之外，有研究发现L/>‑
谷氨酰胺酶对人乳腺癌细胞系表现出抗肿瘤特性，且在艾滋病毒感染的细胞内抑制艾滋病毒的复制。总而言之，谷氨酰胺酶作为一种抗癌剂，在医学上具有重要的潜在应用价值。
[0005]已知在酱油发酵过程中，高浓度的氯化钠(16％～18％)能够显著抑制大豆或米曲霉产生的谷氨酰胺酶活性，因此，开发具有高耐盐性的谷氨酰胺酶对于将L
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谷氨酰胺有效转化为L
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谷氨酸是十分重要的。1999年I Sato等人从日本土壤中分离出一株能产耐盐耐热谷氨酰胺酶的变形担子酵母，并将其归为隐球菌(Cryptococcus nodaensis)。接着，Kotaro Ito等人于2011年将该隐球菌来源的谷氨酰胺酶在酿酒酵母中进行异源表达，但跟出发菌株一样，这种高耐盐性的谷氨酰胺酶并不能分泌至胞外，只能在细胞表面分析其活性(表1)。
[0006]表1：谷氨酰胺酶表达的研究进展
[0007][0008][0009]里氏木霉(Trichoderma reesei)是美国FDA认证的安全生产菌株，蛋白表达分泌能力强，某些突变株的胞外蛋白分泌量可达到100g/L，且具有与高等哺乳动物相似的蛋白翻译后修饰系统，因此里氏木霉非常适合表达真核来源的食品、药品级蛋白。
[0010]鉴于高耐盐性的谷氨酰胺酶在发酵食品加工过程中的重要作用，实现高耐盐性谷氨酰胺酶的高产分泌表达就变得至关重要。

技术实现思路

[0011]为了解决这个问题，本研究利用里氏木霉作为表达宿主，成功实现了隐球菌(Cryptococcus nodaensis)来源的谷氨酰胺酶的外泌表达，且产量较高。
[0012]本专利技术提供了一种谷氨酰胺酶的编码基因，所述编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0013]本专利技术还提供了一种携带上述基因的重组载体。
[0014]本专利技术还提供了一种携带上述基因或上述重组载体的宿主细胞。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
[0016]本专利技术还提供了一种重组里氏木霉，所述重组里氏木霉表达了谷氨酰胺酶，编码所述谷氨酰胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组里氏木霉的表达载体为：以pEASY
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blunt T simple质粒为出发质粒，按照dcl的启动子、dcl的信号肽、谷氨酰胺酶编码基因、cbh2终止子的顺序整合至出发质粒上，以启动和终止谷氨酰胺酶的表达；所述dcl的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述dcl的信号肽的序列如SEQ ID NO.3所示；在谷氨酰胺酶的编码基因前连接dcl的信号肽并利用dcl的启动子启动谷氨酰胺酶的表达；所述cbh2终止子的序列如SEQ ID NO.4所示。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，以里氏木霉TU6作为出发菌株。
[0019]本专利技术还提供了一种提高谷氨酰胺酶酶活或热稳定性或耐盐性的方法，所述方法为，采用里氏木霉TU6作为出发菌株，表达了谷氨酰胺酶，编码所述谷氨酰胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0020]本专利技术还提供了上述重组谷氨酰胺酶的制备方法，所述方法为，采用上述宿主细胞或上述重组里氏木霉发酵制备得到重组谷氨酰胺酶。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为，将筛选得到的阳性转化子孢子液按照0.4％(体积比)接种至50ml预培养的培养基(MM+2％葡萄糖)中，孢子浓度为107数量级，28℃，200rpm培养36h～48h后，无菌条件下利用纱布过滤菌丝，弃滤液，使用MM培养基冲洗菌
丝后，将菌丝转移接种至50ml诱导培养基(MM+1％微晶纤维素)中，28℃，200rpm诱导培养5天，离心收集发酵液。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，MM+2％葡萄糖培养基为：(NH4)2SO
4 0.5％(5g/L)，KH2PO41.5％，MgSO
4 0.06％，CaCl
2 0.06％，FeSO4·
7H2O 0.0005％，MnSO4·
H2O 0.00016％，ZnSO4·
7H2O0.00014％，CoCl
2 0.0002％，葡萄糖2％，氢氧化钠调pH 5.1～5.3，115℃高压蒸汽灭菌20分钟。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，MM+1％微晶纤维素为：(NH4)2SO
4 0.5％(5g/L)，KH2PO41.5％，MgSO
4 0.06％，CaCl
2 0.06％，FeSO4·
7H2O 0.0005％，MnSO4·
H2O 0.00016％，ZnSO4·
7H2O0.00014％，CoCl
2 0.0002％，Avicel(微晶纤维素；品牌：SIGMA，CAS号：9004
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6)1％；氢氧化钠调pH 5.1.～5.3，115℃高压蒸汽灭菌20分钟。
[0024]本专利技术还提供了上述重组里氏木霉的构建方法，所述方法为：
[0025](1)构建表达谷氨酰胺酶的重组质粒；
[0026](2)将重组质粒导入里氏木霉中构建得到重组里氏木霉。
[0027]本专利技术还提供了一种制备谷氨酸的方法，所述方法为，将上述宿主细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种谷氨酰胺酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因的序列如SEQ ID NO.1所示。2.携带权利要求1所述基因的重组载体。3.携带权利要求1所述基因或权利要求2所述重组载体的重组细胞。4.根据权利要求3所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。5.一种重组里氏木霉，其特征在于，所述重组里氏木霉表达了谷氨酰胺酶，编码所述谷氨酰胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。6.根据权利要求5所述的重组里氏木霉，其特征在于，所述重组里氏木霉的表达载体为：以pEASY
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blunt T simple质粒为出发质粒，按照dcl的启动子、dcl的信号肽、谷氨酰胺酶编码基因、cbh2终止子的顺序整合至出发质粒上，以启动和终止谷氨酰胺酶的表达；所述dcl的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述dcl的信号肽的序列如SEQ ID NO.3所示；在谷氨酰胺酶的编码基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩峰，陈永丽，潘朝智，
申请(专利权)人：深圳中科欣扬生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：