缀叶丛螟液泡ATP酶A亚基（LmV-ATPaseA）基因、其dsRNA及其合成方法和抗虫性应用技术

本发明专利技术公开了一种缀叶丛螟液泡ATP酶A亚基(LmV

【技术实现步骤摘要】
缀叶丛螟液泡ATP酶A亚基(LmV
‑
ATPase A)基因、其dsRNA及其合成方法和抗虫性应用


[0001]本专利技术涉及林业害虫防治
，具体涉及一种缀叶丛螟液泡ATP酶A亚基(LmV
‑
ATPase A)基因、其dsRNA及其合成方法和抗虫性应用。

技术介绍

[0002]缀叶丛螟(Locastra muscosalis Walker)又称核桃缀叶螟，属于鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)，该害虫在我国南部爆发区域较多，主要危害漆树、黄连木、胡桃楸、枫香等树木。随着近几年气温升高和城市效应加剧，缀叶丛螟逐年向北扩散为害，现今在辽宁省及黑龙江省都见报道。缀叶丛螟幼虫一次性孵育数量多，吐丝结巢裹覆叶片，且活泼易动，受惊时会迅速后窜藏于叶内，且迁移性较强，幼龄及熟龄幼虫皆耐饥饿，因此一旦爆发常常危害数棵邻近树木，尤其对树种单一的种子园或人工林危害严重，如不在爆发初期迅速处理则容易造成同一林区连年受灾，严重影响树木成活性及观赏性。对该害虫的治理防治有人工治理、物理防治、化学防治、生物防治等，其中应用性较强的方式还是以喷洒氯氰菊酯及除虫脲等药物为主的化学防治。
[0003]RNA干扰又名基因沉默，是指由双链RNA分子诱导与之同源的mRNA特异性降解，使得特定的靶标基因沉默的现象。RNAi技术因其高效性、特异性及可遗传性等特性成为昆虫防治的重要方法之一，它的主要作用方式就是通过注射法、饲喂法、浸泡法等将靶标基因的dsRNA导入昆虫体内，使其沉默内源基因，造成昆虫发育障碍、繁殖量减少甚至死亡。
[0004]液泡ATP酶又称V
‑
ATP酶(Vacuolar
‑
type ATPase，V
‑
ATPase)是一种广泛存在于真核细胞多种细胞器膜及某些细胞质膜上的一种ATP水解驱动的质子泵。在昆虫中，V
‑
ATP酶主要存在于中肠、唾液腺和马氏管中。该酶主要通过水解ATP产生能量来驱动氢离子的膜内外转运，从而产生跨膜电化学梯度，并且借此调节生物膜内外的pH值。V
‑
ATPase在神经递质释放、蛋白质转运、细胞内吞等方面起着重要作用，在对多种昆虫V
‑
ATP酶A亚基的研究中发现，该催化亚基的序列是高度保守的，在昆虫整个生命周期中均有表达，尤其在幼虫期及中肠的表达量较高。至今在多种昆虫中都发现了因沉默V
‑
ATPase A基因引起的致死效应，而国内外还没有关于缀叶丛螟V
‑
ATPase A的任何研究报告。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术目的在于提供一种缀叶丛螟液泡ATP酶A亚基(LmV
‑
ATPase A)基因，可作为药物靶点，进行缀叶丛螟防治。
[0006]本专利技术另一个目的在于提供基于上述缀叶丛螟LmV
‑
ATPase A基因合成的dsRNA方法，缀叶丛螟幼虫摄入dsRNA后可使其致死，起到防治的作用。
[0007]为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用以下技术方案：
[0008]本专利技术提供一种缀叶丛螟LmV
‑
ATPase A基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1"LmV
‑
ATPase A"所示，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2"LmV
‑
ATPase A"所示，LmV
‑
ATPase A基因编码区全长1854bp，编码617个氨基酸，蛋白的分子式为C
3042
H
4801
N
801
O
924
S
25
。
[0009]本专利技术提供基于上述缀叶丛螟LmV
‑
ATPase A基因合成的dsRNA靶标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3"dsLmV
‑
ATPase A"所示。
[0010]本专利技术还提供用于获得所述缀叶丛螟LmV
‑
ATPase A基因的引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4"LmV
‑
ATPase A
‑
F"和SEQ ID NO:5"LmV
‑
ATPase A
‑
R"所示。
[0011]本专利技术还提供用于合成所述RNAi干扰目的片段的引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6"YLmV
‑
ATPase
‑
F"和SEQ ID NO.7"YLmV
‑
ATPase
‑
R"所示。
[0012]本专利技术还提供基于上述缀叶丛螟LmV
‑
ATPase A基因诱导dsRNA表达的方法，包括以下步骤：
[0013](1)基于缀叶丛螟转录组数据分析，设计并合成用于克隆LmV
‑
ATPase A基因开放阅读框的特异性引物，上游引物序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物序列如SEQ ID NO:5所示，引物由生物公司合成；
[0014](2)提取缀叶丛螟总RNA，通过RT
‑
PCR反转录得到cDNA；
[0015](3)以(2)中得到的cDNA为模板和(1)中合成的引物进行LmV
‑
ATPase A基因全长的PCR扩增，PCR体系为：模板2μL、10x聚合酶buffer 5μL、上游引物1.5μL、下游引物1.5μL、R taq酶1μL、2.5mM dNTP 5μL、ddH2O 34μL，扩增程序为：94℃3min；94℃30s、58℃1min、72℃1min，共30个循环；72℃8min；
[0016](4)PCR产物测序后使用在线分析软件分析基因序列，并选择合适的RNAi干扰靶标片段，设计带有载体L4440酶切位点Sac
ꢀⅠ
(gagctc)和Xba
ꢀⅠ
(tctaga)的特异性引物，上游引物序列如SEQ ID NO.6所示，下游引物序列如SEQ ID NO.7所示；
[0017](6)构建含有上述选定目的基因片段的L4440载体，以GFP序列片段作为阴性对照，并转入宿主大肠杆菌HT115中获得HT115
‑
L4440
‑
LmV
‑
ATPase A菌液及阴性对照的HT115
‑
L4440
‑
GFP菌液；
[0018](7)dsRNA的诱导表达：对(6)中转化的大肠杆菌进行PCR验证，对验证后的大肠杆菌按照1:50比率接种于含有100mg/L氨苄青霉素及50mg/L四环素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，之后在按照菌液：培养基＝1：100的比例再次培养，37℃，200rpm/mim培养约3
‑
4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种缀叶丛螟液泡ATP酶A亚基(LmV
‑
ATPaseA)基因、其dsRNA及其合成方法和抗虫性应用，其特征在于：(1)LmV
‑
ATPaseA基因来自于缀叶丛螟，通过引物设计、合成、PCR扩增、测序、序列分析等确定LmV
‑
ATPaseA基因序列的准确性；(2)对LmV
‑
ATPaseA基因RNAi干扰的靶标序列预测，设计并合成引物，PCR扩增，构建选定目的基因片段的L4440载体，转入宿主大肠杆菌HT115中获得HT115
‑
L4440
‑
LmV
‑
ATPase A菌液；(3)IPTG诱导确定LmV
‑
ATPaseA基因的dsRNA的表达；(4)对缀叶丛螟幼虫进行LmV
‑
ATPaseA基因的dsRNA的饲喂，可以使缀叶丛螟幼虫有明显的进食障碍等异常表现而死亡的现象。2.根据权利要求1所述的缀叶丛螟液泡ATP酶A亚基(LmV
‑
ATPaseA)基因、其dsRNA及其合成方法和抗虫性应用，其特征在于：权利要求1所述LmV
‑
ATPaseA基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1"LmV
‑
ATPase A"所示，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2"LmV
‑
ATPaseA"所示，缀叶丛螟的LmV
‑
ATPaseA基因编码区全长1854bp，编码617个氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：景天忠，齐凤慧，王雯萱，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：