应用岩藻糖基转移酶生产2制造技术

本发明专利技术公开了应用岩藻糖基转移酶生产2

【技术实现步骤摘要】
应用岩藻糖基转移酶生产2
’‑
岩藻糖基乳糖的方法


[0001]本专利技术涉及应用岩藻糖基转移酶生产2
’‑
岩藻糖基乳糖的方法，属于微生物发酵工程领域。

技术介绍

[0002]母乳是新生婴儿重要的营养来源，它含有多种有益成分。母乳低聚糖(HMO)是母乳中独特的哺乳动物低聚糖，也是含量第三丰富的成分(5
‑
15g/L)，仅次于乳糖(70g/L)和脂质(40g/L)，对婴幼儿的健康成长和发育有重要的作用。越来越多的证据表明，母乳低聚糖(HMO)可能是母乳能有良好功效的关键因子，可介导细胞之间的通讯过程，如细胞识别、肿瘤发现和病原体粘附。此外，HMO衍生的相关物质，特别是大脑中大量存在的岩藻糖基和半乳糖基部分，对大脑发育和认知具有重要意义。
[0003]鉴于HMO提供的不可替代的生理功能，婴儿配方奶粉和益生元市场对其的需求越来越大。迄今为止，已经鉴定出200多种不同的HMO，其中大约一半以上的HMO是岩藻糖基化的，主要包括2'
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岩藻糖乳糖(2'
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FL)、3'
‑
岩藻糖乳糖(3'
‑
FL)、乳糖
‑
N
‑
岩藻五糖(LNFP)和乳糖
‑
N
‑
二岩藻六糖(LNDFH)。2'
‑
FL是一种由乳糖和岩藻糖通过一个α
‑
(1,2)
‑
键形成的三糖，是最丰富(占HMO总量的30％以上)、功能最重要的HMO之一。
[0004]目前，通过微生物发酵工程合成2'
‑
FL已被证明优于酶法和化学合成法等，其具备生长周期短，操作简便，可大规模发酵等优势。2'
‑
FL的微生物生产受多方面因素影响，异源表达具有高催化活性的α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶(α
‑
1,2
‑
FucTs)是关键的限速步骤。对于不同来源α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶的筛选在国内外屡见不鲜，常见如来自Helicobacter pylori的fucT2、大肠杆菌O126(WbgL)，它们具有用于供体
‑
底物结合的高度保守基序I(HxRRxD)的排列氨基酸序列，这可能是相关底物催化活性的关键位点。但现有的文献专利对于α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶的热稳定性研究较少，一般认为，热稳定性高的酶会提高生产效率。因此，为了实现2'
‑
FL工业化大规模生产，筛选活性高、热稳定性好的关键酶至关重要。

技术实现思路

[0005][技术问题][0006]缺少2
’‑
岩藻糖基乳糖产量高、热稳定性好的岩藻糖基转移酶。
[0007][技术方案][0008]本专利技术披露了一种新型α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶，所述新型α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶是指从云南热泉环境所获取的微生物基因资源库中筛选得到的。构建α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶的表达质粒并转入敲除wcaJ、lacZ基因的宿主菌，培养所得重组菌使之以甘油和乳糖为底物获得了高产量的2
’‑
岩藻糖基乳糖。
[0009]本专利技术的第一个目的是提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的新型α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶(EC2.4.1.69)，命名为CP8899，来源为云南热泉环境所获取的微生物基因资源
库。该新型α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶具有良好的热稳定性。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，编码新型α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述新型α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶来源于Mycobacterium sp.。
[0012]本专利技术的第二个目的是提供一种能够表达所述新型α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶的基因工程菌，所述基因工程菌敲除了β
‑
半乳糖苷酶基因lacZ基因和UDP
‑
葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌的底盘菌株包括但不限于大肠杆菌BW25113。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述敲除是使用CRISPR
‑
Cas9方法进行的。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述β
‑
半乳糖苷酶基因lacZ的NCBI序列号为NP_4184878.1；所述UDP
‑
葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ的NCBI序列号为NP_416551.1。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，以pBAD为表达载体，表达新型α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶的编码基因。
[0017]本专利技术的第三个目的是提供一种生产2
′‑
岩藻糖基乳糖的方法，所述方法是应用所述基因工程菌进行发酵生产。
[0018]将所述基因工程菌接种到无机盐培养基中，以甘油作为初始碳源，进行发酵生产。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述初始碳源的终浓度为10.0
‑
30.0g/L。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述无机盐培养基包括：甘油10.0
‑
30.0g/L、KH2PO
4 13.0g/L、(NH4)2PO44.0g/L、柠檬酸1.7g/L、MgSO4·
7H2O 1.4g/L、CaCl
2 0.1g/L、微量元素10mL/L[母液：10g/L Fe(III)citrate、2.25g/L ZnSO4·
7H2O、1.0g/L CuSO4·
5H2O、0.35g/L MnSO4·
H2O、0.23g/L Na2B4O7·
10H2O、0.11g/L(NH4)6Mo7O
24
、2.0g/L CaCl2·
2H2O]，pH调节到7.0
‑
7.2。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，发酵培养条件为37℃，220rpm。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵为分批补料方式。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述分批补料是指待所述初始碳源甘油消耗完全后，补充50％甘油和终浓度为5g/L的乳糖。
[0024]本专利技术的第四个目的是提供了新型α...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种岩藻糖基转移酶，其特征在于，所述岩藻糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述岩藻糖基转移酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种能够表达权利要求1所述岩藻糖基转移酶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌敲除了β
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半乳糖苷酶基因lacZ和UDP
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葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ。4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的底盘菌株包括但不限于大肠杆菌BW25113。5.根据权利要求3或4所述的基因工程菌，其特征在于，以pBAD为表达载体，表达新型α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶的编码基因。6.一种生产2
′‑
岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述方法是应用权利要求3
‑
5任一项所述基因工程菌接种到无机盐培养基中，以甘油作为初始碳源，进行发酵生产2
′‑
岩藻糖基乳糖。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述无机盐培养基包括甘油10.0
‑
30.0g/L、KH2PO
4 13.0g/L、(NH4...

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩峰，胡松，陈永丽，潘朝智，顾丽红，
申请(专利权)人：深圳中科欣扬生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：