葡萄糖基转移酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株和酶制剂以及它们的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，公开了一种葡萄糖基转移酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株和酶制剂以及它们的应用。该葡萄糖基转移酶突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的R位进行点突变，并在其N端添加4

【技术实现步骤摘要】
葡萄糖基转移酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株和酶制剂以及它们的应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种葡萄糖基转移酶突变体及其编码基因，一种重组载体，一种重组菌株，一种酶制剂，一种制备天麻素的方法，以及它们在制备天麻素中的应用和制备天麻素的方法。

技术介绍

[0002]葡萄糖基转移酶(Glycosyltransferase)可以特异性地将糖基团从活性中间体(例如UDPG)转移到受体分子上，具有较好的催化效率和区域选择性，是糖苷类化合物合成与制备的理想催化剂。葡萄糖基转移酶在自然界尤其是植物中广泛存在，对于植物次级代谢产物的调控有着重要的作用，植物中许多重要天然产物的有效成分都是以其糖苷形式存在的。葡萄糖基转移酶作为实现天然产物糖基化的重要催化剂，其催化机理、构效关系以及选择性机制得以一定程度的研究解析。葡萄糖基转移酶良好的催化特性已经成功应用于部分糖苷类天然产物的生产合成，是一种极具工业应用价值的酶。
[0003]天麻素(Gastrodin)，又称4
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羟甲基苯基
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β
‑
D
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吡喃葡萄糖苷，是中药天麻的主要生物活性成分，其含量是评价天麻质量的首选指标，如今，天麻素已被广泛的应用于医疗药品和保健食品两大领域。天麻素可以作为单用治疗药物也可以联合用药，主要用于扩张血管、增强血管弹性、改善因供血不足而引发的脑血管疾病和精神疾病以及早年性老年痴呆，相关制剂包括天麻素注射液、天麻素片、乙酰天麻素片等；此外，因其改善睡眠、降血压、增强免疫力等功效，也被作为一些保健品的原料，据统计以天麻素为主要药效成分的保健食品多达117种，且该类保健品深受大众欢迎。
[0004]目前，人们对以天麻素为主要药效成分的天麻需求量不断增长，随着应用范围的进一步扩大，市场前景广阔。然而，就天麻素的工业化生产而言，主要还是依靠植物提取法和化学合成法，对于现代化工业生产的长远性、环保性及可持续发展性是无法满足的。因此，亟待开发天麻素绿色、可持续生产的新模式，其中，微生物合成法是实现其绿色、安全、可持续工业生产的最主要途径，天麻素在结构上由4
‑
羟基苯甲醇和葡萄糖两部分组成，天麻素合成的最后一步为对羟基苯甲醇的糖苷化，葡萄糖基转移酶担任重要的作用，但是，现有的葡萄糖基转移酶的特异性有待提高，进而对羟基苯甲醇转化成天麻素的转化率较低。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的葡萄糖基转移酶的特异性有待提高、对羟基苯甲醇转化成天麻素的转化率较低的问题，提供一种葡萄糖基转移酶突变体及其编码基因，一种重组载体，一种重组菌株，一种酶制剂，以及它们在制备天麻素中的应用和一种制备天麻素的方法，该葡萄糖基转移酶突变体具有更高的特异性，能够有效提高对羟基苯甲醇转化成天麻素的转化率。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种葡萄糖基转移酶突变体，该葡萄糖
基转移酶突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的R位进行点突变，并在其N端添加4
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8个组氨酸。
[0007]优选地，所述R位为第15位，所述SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的N端添加6个组氨酸。
[0008]优选地，该葡萄糖基转移酶突变体具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的酶。
[0009]本专利技术第二方面提供一种编码葡萄糖基转移酶突变体的基因，该基因具有编码上述的葡萄糖基转移酶突变体的核苷酸序列。
[0010]优选地，所述基因具有编码具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列。
[0011]更优选地，所述基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
[0012]本专利技术第三方面提供一种重组载体，所述重组载体含有上述的基因。
[0013]优选地，所述重组载体的表达载体为pET28a质粒。
[0014]本专利技术第四方面提供一种重组菌株，所述重组菌株含有上述的基因或者上述的重组载体。
[0015]优选地，所述重组菌株为大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌。
[0016]更优选地，所述重组菌株为大肠杆菌。
[0017]本专利技术第五方面提供一种葡萄糖基转移酶突变体的制备方法，该制备方法包括：将上述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵。
[0018]本专利技术第六方面提供一种酶制剂，该酶制剂包含上述的方法制得的葡萄糖基转移酶突变体。
[0019]本专利技术第七方面提供上述的葡萄糖基转移酶突变体、上述的基因、上述的重组载体、上述的重组菌株、上述的方法制得的葡萄糖基转移酶突变体和上述的酶制剂中的至少一种在制备天麻素中的应用。
[0020]本专利技术第八方面提供一种制备天麻素的方法，该方法包括以下步骤：将上述的葡萄糖基转移酶突变体、上述的基因、上述的重组载体、上述的重组菌株、上述的方法制得的葡萄糖基转移酶突变体和上述的酶制剂中的至少一种与对羟基苯甲醇、二磷酸尿苷葡糖接触。
[0021]优选地，所述对羟基苯甲醇与所述二磷酸尿苷葡糖的重量比为1:1.5
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2.5；所述接触的条件包括：温度为25
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35℃，时间为4
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8h。
[0022]通过上述技术方案，本专利技术的有益效果为：
[0023]本专利技术提供的葡萄糖基转移酶突变体，相较于原始的葡萄糖基转移酶，对于底物对羟基苯甲醇的特异性较高，进而使得对羟基苯甲醇转化成天麻素的转化率明显提高，天麻素的产量可提高31％左右；该葡萄糖基转移酶突变体对于天麻素的绿色、安全、可持续工业生产具有重要的意义，具有较好的工业应用前景。
附图说明
[0024]图1为实施例3中对羟基苯甲醇标准样品的高效液相色谱图；
[0025]图2为实施例3中天麻素标准样品的高效液相色谱图；
[0026]图3为实施例3中E.coli BL21(DE3)/pET28a
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slyUGTmut催化合成天麻素后反应液的高效液相色谱图；
[0027]图4为对比例1中E.coli BL21(DE3)/pET28a
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slyUGT催化合成天麻素后反应液的高效液相色谱图。
具体实施方式
[0028]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0029]本专利技术第一方面提供一种葡萄糖基转移酶突变体，该葡萄糖基转移酶突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的R位进行点突变，并在其N端添加4
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8个组氨酸。
[0030]本专利技术的专利技术人在研究过程中，意外地发现，基于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的葡萄糖基转移酶作为UG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，该葡萄糖基转移酶突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的R位进行点突变，并在其N端添加4
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8个组氨酸所形成的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述R位为第15位，所述SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的N端添加6个组氨酸；优选地，该葡萄糖基转移酶突变体具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的酶。3.一种编码葡萄糖基转移酶突变体的基因，其特征在于，该基因具有编码权利要求1或2所述的葡萄糖基转移酶突变体的核苷酸序列；优选地，所述基因具有编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列；优选地，所述基因具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求3所述的基因；优选地，所述重组载体的表达载体为pET28a质粒。5.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求3所述的基因或者权利要求4所述的重组载体。6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌；优选地，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾洋，朱姜，林铭鑫，陆蕙芝，柳隐芳，李昌凡，黄和，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：